微生物研究技术习题

1、11第一章 绪论1. 微生物的应用（1）直接利用微生物营养菌体单细胞蛋白（Single Cell Protein, SCP ）、酸奶、微生态制剂、疫苗，酵母片、蘑菇和受体菌等.（2） 利用微生物代谢产物如：包括初级代谢产物和次生代谢产物，各种氨基酸、有机酸、抗生素、酶类等.（3） 利用微生物的基因 主要是不可培养微生物 采样®提取总的DNA ® 基因克隆 ® 目的基因表达（4） 利用微生物的新陈代谢如：微生物的分解、转化、修饰作用（5）利用微生物的拮抗作用如：生物防治、生物农药等2微生物的应用领域（1）在环境污染物治理与修复中的应用（2）在发酵工业中的应用 有机酸

2、：柠檬酸、乳酸、乙酸等 氨基酸：各种氨基酸，如谷氨酸等 抗生素：青霉素、链霉素 酶制剂等：工业用酶：如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶，科研用酶：如限制性内切酶等 （3） 在农业中的应用 肥料：固氮菌肥，磷细菌肥，钾细菌肥料 杀虫剂： 病毒杀虫剂，真菌杀虫剂（白僵菌），农用抗生素：5406，植物生长促进剂等 （4）在医学中的应用： 疫苗的制备和大规模生产；抗生素治疗；针对病原菌开展的以预防、治疗疾病为目的的各项研究；（5）技术应用 PCR（从嗜热菌中分离的DNA聚合酶），利用质粒、病毒为载体进行基因工程研究；利用细菌细胞固定化技术进行发酵生产；基因工程技术。（6）特殊应用降解疯牛病蛋白的酶；能“挤出”

3、石油的细菌；能制氢的细菌；能治理污水的细菌；能清洁土壤中毒素的细菌；能协助排雷的细菌；第三章 菌株的分离与筛选1.什么是富集培养？答：富集培养：指在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境中的优势种，以利于分离到所需要的菌株。2. 哪些分离方法能达到“菌落纯”？ 哪些分离方法能达到“细胞纯（菌株纯）”？答：菌落纯：稀释分离法、划线法、组织法细胞纯：单细胞或单孢子的分离法3. 分离好氧微生物常用的方法有哪些？答：(1)稀释涂布法(2)划线分离法(3)平皿生化反应分

4、离法4. 平皿生化反应分离法有哪些？分别用来筛选哪些菌？各自原理如何？答：(1)透明圈法 原理：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小可以放映该菌株利用底物的能力。 筛选：水解酶产生菌(2)显色圈法 原理：在底物平板中加入特定的指示剂或显色剂，根据颜色变化，将目的微生物快速分离出来。筛选：果胶酶产生菌、分离谷氨酸产生菌、分离解脂微生物、分离内肽酶产生菌(3) 生长圈法 原理：将待测菌涂布于含高浓度的工程菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。 筛选：氨基酸、核

5、苷酸和维生素产生菌(4)抑菌圈法 原理：待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。筛选 ：抗生素产生菌5. 常用的平板初筛的方法有哪些？答：方法：(1)形态变异筛选法（2）平皿生化反应筛选法 (3)浓度梯度法(4)染色技术快速筛选法(5)琼脂块大通量筛选法 6. 初筛和复筛的要求有何不同？答：初筛是指从大量的菌落中随机挑取进行摇瓶试验并通过检测得到一些较优菌株。 复筛是指将初筛得到的较优菌株再进行多次摇瓶实验验证其效价和传代稳定性，并从中得到一两个或少数几个最优的菌株。初筛要求：筛选的菌株

6、尽可能多，筛选的菌株越多，就越有希望筛选到所需要的菌株。筛去明确不符合要求的大部分菌株，把具有生产性状的菌株尽量保存下来。复筛要求：做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平。7菌株的分离和筛选一般可分为如下几个步骤：采样，富集培养，分离纯化，产物鉴别，菌种鉴定，菌种保藏8. .CM、MM、SM、LM分别表示什么培养基？ 答：CM-完全培养基 FM-发酵培养基 MM-基本培养基 SM-补充培养基 LM-有限培养基9.什么是菌种退化？菌种退化的原因是什么？如何防止菌种退化？ 答：菌种退化：指生产菌株或选育过程中筛选出来的较优良菌种在生产繁殖中，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现

7、象，集中表现在菌种目的代谢产物合成能力降低，产量下降有的是发酵力和糖化力降低。 原因：(1)基因变异(2)分离现象(3)不适宜的环境条件(4)传代次数的增加防止措施：1.采用合理的育种方法，减少分离现象 2.选择适合菌种生长的培养条件和外界环境 3.采用有效的菌种保藏方法，控制传代次数4.防止病毒感染 5.定期进行纯种分离 10.常用的菌种保藏方法有哪些？ 答：(1)斜面低温保藏法 (2)普通冷冻保藏法 (3)超低温冷冻保藏法 (4)液氮超低温保藏法(5)沙土管保藏法(6)冷冻真空干燥保藏法 (7)液体石蜡保藏法 第三章 目的基因克隆1 T-RFLP技术分析微生物生态原理：T-RFLP是末端限

8、制性片段长度多态性，它是根据16S rRNA的保守区设计通用引物。提取待分析样品的总DNA，以它为摸板进行PCR扩增，然后，将PCR产物用合适的限制性内切酶消化，一般选用酶切位点为4bp的限制性内切酶。由于在不同细菌的扩增片段内存在核苷酸序列的差异，酶切位点就会存在差异，酶切后就会产生许多不同长度的限制性片段。这些不同长度的片段就可以反映微生物群落组成情况，因为不同长度的末端限制性片段必然代表不同的细菌，也就是说一种末端限制性片段至少代表一种细菌。 2 T-RFLP技术步骤3 菌种鉴定包括：形态鉴定， 生理生化鉴定， 16Sr DNA测序，ITS测序16Sr DNA鉴定： 根据16Sr DNA

9、序列通用引物(27F/1492R)对目标菌株16Sr DNA进行PCR扩增，可以提取总DNA，菌落PCR，菌液PCR等。 将PCR产物直接送测（易出现双峰，测序不成功） 将PCR产物酶连至pMD19-T,转化至大肠杆菌，挑取阳性单克隆培养，提取质粒电泳检测后送测（不易双峰，但可能有错配）4 高通量筛选(High throughput screening，HTS)HTS技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体系运

10、转的技术体系。5基因组文库的构建过程？如何确定文库的大小？基因组文库的构建过程：1）从生物体提取大片断的基因组DNA；2）用适当的限制性内切酶（常为4碱基识别位点）进行部分酶切或超声波打断基因组DNA ；3）在琼脂凝胶电泳上或蔗糖梯度离心筛选适当长度的DNA片断（根据载体的要求）； 4）载体的酶切、回收；5）将处理好的基因组DNA片断与载体连接；6）将重组子导入宿主细胞7）文库的鉴定、收集、保存；确定文库大小的方法：以在构建的基因组文库中任一基因存在的概率来衡量文库的质量或完备性，它与基因文库最低所含克隆数N（即文库大小）之间的关系可用下式表示： N = ln ( 1 P ) / ln ( 1

11、 f ) 其中： N：文库所需的总克隆数； P：任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率； f：克隆片段的平均大小/ 生物基因组的大小。6一般质粒DNA的构型有哪几种？在琼脂糖凝胶电泳中的有何特点？超螺旋质粒DNA、开环质粒DNA、线状质粒DNA在琼脂糖凝胶电泳的特点是：电泳的泳动速度由大到小分别是：超螺旋质粒DNA>线状质粒DNA>开环质粒DNA7 电泳缓冲液使用一定时间后出现DNA在凝胶中跑不动现象的原因，有何解决办法？原因：电泳缓冲液的离子的富集作用；解决方法：1.更换成新配置的电泳缓冲液； 2.把电泳槽中的缓冲液倒出混匀后再重新使用8 电泳的指示剂和染色剂有何区别，各自的

12、作用是什么？指示剂一定要在电泳前加入，指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液；（一般为：溴酚兰，二甲苯青）作用：预知电泳的速率及方向；使样品呈现颜色，便于加样；一些高浓度蔗糖或其它物质增加DNA的密度，可以防止DNA的扩散染色剂即可以在电泳前加入样液，又可以电泳后再对凝胶染色；（溴化已锭EB、硝酸银、Goldview染料）作用：呈现出核酸电泳后的带型。9 大肠杆菌表达外源基因的优势： ò全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架； ò基因克隆表达系统成熟、完善； ò繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定； ò被FDA批准为安全的基因工程受体生

13、物。大肠杆菌表达外源基因的劣势： ò缺乏对真核生物蛋白质的复性功能； ò缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统； ò内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白； ò周质内含有种类繁多的内毒素。10如何提高克隆基因的表达水平？1）、表达载体的优化设计；2）、提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性；3）、密码子偏爱性；4）、表达环境条件的优化。11根据表达蛋白用途的不同，设计选择基因的表达策略。（1）表达蛋白用于生物化学和分子生物学研究 主要考虑保持蛋白质原有的功能不变；表达策略：融合表达和直接表达（2）表达蛋白用作抗原主要考虑表达蛋白的快速提纯；表达策略：以

14、包涵体形式合成目的蛋白和融合表达目标蛋白（不用去除标签蛋白）（3）表达蛋白用作结构研究表达蛋白以天然可溶形式产生；表达时考虑因素：表达温度（高温促进包涵体的形成）；表达水平（高表达促成包涵体的形成）；表达载体受体菌。12质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？A、 化学法（CaCl2法)转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内（感受态细胞）。B、 电穿孔转化转化原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场，在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA

15、重组分子便可进入细胞内。影响转化率的主要影响因素:1）载体本身的性质及其空间构象：超螺旋构象转化率最高；2）插入片段的大小：插入片段越大，转化效率越低；3）受体细胞的类型及预处理；4）转化方法：电击法高于化学法。第四章 蛋白质工程与现代生物技术1.生物技术 2.抗生素 3.内源性感染 4.高通量筛选 5.基因药物 6.朊粒 7.活性污泥法 8.固体废弃物 9.生物制浆 10.生物漂白 11细胞工程 12原始菌株 13基因工程疫苗 14抗生素超敏菌株 15废水处理的微生物技术 16单细胞蛋白 17生物能源 18农用抗生素 二，选择题1.抗生素的基本特性（ ）A.分子结构的多样性 B.选择性 C.

16、不溶解性 D.稳定性2.微生物的新陈代谢包括微生物的（ ）A.修饰 B.固定 C.分解 D.转化3.广谱抗生素不包括（ ）A.抗菌 B,抗立克次氏体 C,抗支原体 D.抗衣原体4.下面哪项不是内源性感染的原因（ ）C、 正常菌群突破上皮屏障 B.外源性生物体干扰了宿主的正常功能C.正常菌群向不构成正常微生物区系的部位转移 D.由于外源性病原体感染所导致的宿主免疫功能丧失5.非微生物代谢产物的是（ ）A初级代谢产物 B次级代谢产物 C转化产物 D中间代谢产物6.下列哪一个是新一代病毒疫苗（ ）A基因工程疫苗 B灭活疫苗 C减毒活疫苗 D亚单位疫苗7.用腺病毒介导基因转移的原因 （ ）A感染效率高

17、 B结构简单 C 稳定性高D性价比较高8.在煤炭中的硫占的比重最大的是以什么形式存在 （ ）A硫 B黄铁硫矿 C有机硫 D易脱洗的硫酸盐9.下列微生物中不可用于生产单细胞蛋白的是 （ ）A大肠杆菌 B酵母菌 C霉菌担子菌10.下列因素中不能影响生物制浆的是 （ ）A温度 B通气 C灭菌 D营养物11.利用酶联免疫吸附法原理可测定( ) A.次级代谢产物 B.初级代谢产物 c.还原糖 D.氨基氮 12.基因工程在抗生素研发中的优点（ ）A.、定向 B、稳定 C、高成本 D、高质量13. 目前已发现的可用于生物漂白的主要的微生物不包括（ ） A. 白腐菌 B. 黄孢原毛平革菌 C. 杂色云芝 D.

18、 大肠杆菌14. 煤炭中含量最高的有机硫是（ ） A. 含巯基有机物 B. 硫醚 C. 含多硫链有机物 D. 二苯噻吩15. 在生物漂白中，产生木聚糖酶的主要微生物不包括（ ） A. 酵母菌 B. 出芽短梗霉 C. 木霉 D. 黑曲霉16.抗生素抗菌作用常用的检测不包括 （ ）A.试管稀释法 B.扩散法 C.血清杀菌活性 D.分离法17.PCR技术的特点不包括（ ）A、特异性强 B、灵敏度高 C，时间长 D、操作简便18.处理重金属污染的方法（化学沉淀法、离子交换法、吸附法、膜分离法、电解法、微生物吸附沉淀作用）P34119.降解微生物的关键技术（生物工程技术）第一步（去除微生物的毒性基因）P

19、33720.细菌通过（络合作用）途径吸附重金属P34221.发展单细胞蛋白注意问题（核酸含量高首先要去除）（有重金属类的有毒物要进行严格的质量检测）（尽可能降低其生产成本）P35322.杀虫农用抗生素目前使用方法（阿维菌素）（多奈菌素）（橘霉素）（多杀菌素）P37623.荧光假单胞杆菌作用（可使巨噬细胞功能增强并产生特异性抗体还可以诱导机体产生干扰素及肿瘤坏死因子，是一种免疫佐剂）（P268）24.下列不属于蛋白质结构测定的技术是（ D ）A X射线晶体衍射技术 B 核磁共振波谱技术 C 生物信息学预测蛋白质结构 D 缺失突变技术25. 下列不属于蛋白质结晶技术的是（ D ）A 悬滴法 B 坐

20、滴法 C 微量扩散小室法 D 插入突变法26. 增加蛋白质分子的热稳定性的常用方法是（ A ）A 提高脯氨酸的含量 B 在蛋白质分子中引入二硫键 C 增加蛋白质分子的螺旋 D 增加折叠27. 蛋白质工程的最终目的是( C )A 开发新产品 B 创造新理论 C 制造具有新性能的新蛋白质结构 D 研究蛋白质的氨基酸组成28. 抗体属于（ B ）A 基因 B 蛋白质 C DNA D RNA1.抗虫棉目前分为：转基因单价抗虫棉 、转基因双价抗虫棉。2，枯草杆菌分泌的一种 角蛋白酶 能够分解致疯牛病的毒蛋白3.抗生素的不良反应包括毒性反应，菌群失调引发继发感染，过敏反应4.最理想的基因工程疫苗的条件：

21、无致癌性安全 无毒性 遗传性状稳 无致畸变或流产性。 5固体有机废物处理的的三大技术指卫生填埋、堆肥和焚烧。6.细胞工程的核心技术是 细胞培养与繁殖7.抗生素的传统改良方法自然选育、人工诱变选育8.按菌苗所含的成分，目前人群使用的菌苗有减毒的活菌苗，灭活的死菌苗，纯化的多糖或蛋白成分苗三类。9.反转录病毒是 RNA 病毒，含有两条相同的RNA分子，病毒进入宿主细胞后，病毒RNA即反转录为 双链DNA ，可整合到细胞基因组中。10.目前煤炭脱硫有燃前脱硫 、燃中固硫 、燃后烟气脱硫等3种方法。11.微生物修复方法（原位微生物修复）、（异位微生物修复）P32112.主要微生物种类（真细菌）（非真细

22、菌原核微生物）（古菌）（真核微生物）（ 病毒类）。P81.只有微生物的天然产物才能称为抗生素。（ ）2.经过批准上市的转基因产品是安全的。（）3.初级代谢产物是与菌体生长密切相关的产物。（ ）4.细菌的耐药性的发生和发展是抗生素广泛使用，特别是滥用的结果。（ ）5.研究发现一些具有极强杀伤肿瘤细胞活性的可抗肿瘤抗生素可制备单克隆抗体导向药物生物导弹的弹头（ ）6.由于病毒复制突变率很高，在病毒复制酶错误倾向性及抗病毒药物的选择压力下，不易出现病毒耐药毒株（ ）7.传统活性污泥法是活性污泥最早的应用形式，并一直沿用至今。8.堆肥法可分为好氧堆肥法、厌氧堆肥法和兼性厌氧堆肥法三种。9.用于脱除煤炭

23、中黄铁矿的细菌都属于化能自养型微生物，而异养型微生物只能脱除煤炭中的有机硫。（ ）10.在单细胞蛋白的生产工艺中，若是作为动物饲料的单细胞蛋白，收集离心后的菌体进行洗涤后干燥即可。（ ）.基因工程优越性：它能从极其错综复杂的各种生物细胞内获得所需基因，并将此目的基因在体内进行剪切拼接、重组，并转入到受体细胞中，从而增产出数百数千倍的新型蛋白质。（ ）.腺联病毒只有在辅助病毒存在的条件下，才能在感染的宿主细胞中复制，产生新的病毒颗粒 （ ）4.一般的反转率病毒只感染分裂细胞，有利于选择性杀伤分裂的肿瘤细胞，但不利于遗传病的的基因治疗（ ）.试管稀释法和扩散法是测定药敏试验的两种常用方法。（）.大

24、多数抗生素生物合成石在产生菌的生长后期开始的。（）.SBR法的最大优点是处理效果好，并具有脱氮除磷的功能。.单细胞蛋白对人体无影响，可直接放心食用。（）思考1.简述蛋白质工程研究的基本途径。2.欲使目的蛋白在大肠杆菌中表达，则表达载体的一般特点是什么？3、简述X射线晶体衍射技术测定蛋白质晶体结构的具体步骤。4、简述目的蛋白原核表达的基本步骤。5、简述蛋白质在生物体内的形成的过程.6、蛋白质分子设计的步骤是什么？7. 一个蛋白质由300个氨基酸组成，请简述用搭桥PCR的方法在该蛋白的150个氨基酸处插入GAATCT这 6 个碱基的基本步骤。8、一个蛋白质分子由300个氨基酸编码，欲将第102个氨

25、基酸（由TAC编码）突变成GCT, 简述用搭桥PCR的方法完成突变的步骤。9、怎样用PCR的方法将一个由300的氨基酸编码的蛋白质的200-250个氨基酸之间的序列删除。蛋白质工程:基于对蛋白质结构和功能关系的认识进行分子设计，通过基因工程途径定向地改造蛋白质或创造呵护人类需要的新的突变蛋白质的理论及实践。 蛋白质分子设计为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案即在知道了需要改造的蛋白质的性能及其相应的结构基础之后通过理论的方法，提出蛋白质改造的设计方案。 PDB即蛋白质结构数据库(Protein Data Bank)由美国纽约Brookhaven国家实验室于1971年创建。该数据库主要收集了通过

26、X射线衍射和核磁共振NMR试验测定的蛋白质的三维结构数据还包括核酸、 糖类、蛋白质与核酸复合物的三维结构。 2、请列表总结基因工程和蛋白质工程的相同点、不同之处从结果、实质、流程等方面及其联系。 基因工程 蛋白质工程 相同点 操作环境生物体外操作对象基因操作水平分子 结果 天然存在的蛋白 自然不存在的蛋白 实质 基因重组 基因修饰或基因合成 流程 中心法则 中心法则逆推 联系 蛋白质工程是在基因工程基础上的延伸是第二代基因工程 3、蛋白质工程的基本目标、基本途径是什么 基本目标是以蛋白质分子结构规律及其生物功能的关系为基础通过DNA重组技术从生物细胞中分离出编码蛋白质的基因有针对性地进行基因修

27、饰或基因合成在将其在特定的受体宿主细胞中表达以实现对现有蛋白质的定向改造或设计构建并最终生产出比天然蛋白质性能更加优良更加符合人们需要的新型蛋白质。 基本途径 1分离纯化需要的改造的目的蛋白质 2对已分离纯化的蛋白质进行氨基酸序列测定、蛋白质晶体X射线衍射分析或蛋白质溶液核磁共振分析等一系列测试获得更多的蛋白质的结构与功能的知识信息。 3通过蛋白质序列设计核酸引物或探针从cDNA文库或基因组文库中获取编码该蛋白质的基因序列 4设计改造方案 5对基因序列进行改造 6将改造过的基因片段插入适当的载体并加以表达 7分离、纯化表达产物并对其进行结构和功能检测 4、目前有哪些蛋白质工程分子改造的常用方法 1基因定点突变技术 即通过在DNA水平上进行碱基的取代、插入或缺失达到改变基因从而改变编码的蛋白质的结构的技术。 2基因剪切和融合 将编码某蛋白的部分基因移植到另种蛋白基因上经克隆、表达产生新的融合蛋白。 3基因全合成 合成DNA然后表达出相应蛋白。可以全部由人工控制便于设计和改造还适用于同时实现多处突变。 5、蛋白质工程中增加蛋白质稳定性的基本途径有哪些 稳定蛋白质空间构象的主要因素是蛋白质分子众多基团间的相互作用如肽键和侧链间的氢键、带有不同电荷的侧链间的静电作用、极性氨基酸残基侧链间的偶极作用、疏水残基间的疏水作用