大肠细菌的基因芯片鉴定

1、实验三基因芯片鉴定大肠细菌 基因芯片基因芯片： 是指将特定的是指将特定的dnadna或寡聚或寡聚核苷酸核苷酸片段通过片段通过物理化学物理化学方法固方法固定于玻璃、尼龙甚至塑料片上定于玻璃、尼龙甚至塑料片上, ,使多基因分析可同时进行的一使多基因分析可同时进行的一种装置。种装置。 基因芯片上可固定不同物种特定基因的探针，将从样品基因芯片上可固定不同物种特定基因的探针，将从样品中提取并经中提取并经pcr扩增和荧光标记的特异基因片段与基因芯片扩增和荧光标记的特异基因片段与基因芯片上的探针杂交，利用专门的光学仪器，能够检测到这些杂交上的探针杂交，利用专门的光学仪器，能够检测到这些杂交信号（带有荧光标记

2、的双链核酸），杂交信号出现在某物种信号（带有荧光标记的双链核酸），杂交信号出现在某物种的探针位点上，说明样品来自于该物种。的探针位点上，说明样品来自于该物种。基因芯片上固定探针的方法 通过化学修饰可以使玻片成为表面富含氨基的基片。在通过化学修饰可以使玻片成为表面富含氨基的基片。在中性溶液中，基片上的氨基所带的正电荷与核酸分子上的磷酸中性溶液中，基片上的氨基所带的正电荷与核酸分子上的磷酸所带的负电荷相互作用，使核酸吸附在基片表面。加热和紫外所带的负电荷相互作用，使核酸吸附在基片表面。加热和紫外照射可以增强固定效果，但紫外交联容易导致照射可以增强固定效果，但紫外交联容易导致dnadna断裂或断裂或

3、dnadna分子间形成干扰杂交的网状结构，所以一般还是采用加分子间形成干扰杂交的网状结构，所以一般还是采用加热固定。热固定。 本实验使用的基因芯片上固定有大肠杆菌本实验使用的基因芯片上固定有大肠杆菌hsp70hsp70基因和黄基因和黄单胞菌单胞菌htpghtpg基因的特异探针，可用于鉴定这两种细菌。基因的特异探针，可用于鉴定这两种细菌。 基因芯片制作和检测的原理实验方案 本实验共分为四个部分：本实验共分为四个部分： 一、大肠杆菌培养一、大肠杆菌培养 二、提取大肠杆菌基因组二、提取大肠杆菌基因组dna 三、三、pcr扩增其扩增其hsp70基因，电泳检测扩增产物基因，电泳检测扩增产物 四、扩增产物

4、与基因芯片杂交并检测杂交信号四、扩增产物与基因芯片杂交并检测杂交信号第一部分 细菌培养 配制配制100ml lb液体培养基，蛋白胨液体培养基，蛋白胨1g，酵母提，酵母提取物取物0.5g，氯化钠，氯化钠1g，加重蒸水，加重蒸水100ml，用，用naoh调调ph至至7.0，高压灭菌。，高压灭菌。 将大肠杆菌单菌落接种于将大肠杆菌单菌落接种于lb培养基中，培养基中，37恒恒温摇床上培养过夜，摇床转速约为温摇床上培养过夜，摇床转速约为280r/min。第二部分提取纯化大肠杆菌基因组dna第二部分 实验步骤1、取培养的菌液取培养的菌液10ml，4000r/min离心离心10min，除去上清液。，除去上清

5、液。2、加入、加入1ml te，使细菌沉淀充分悬浮。，使细菌沉淀充分悬浮。3、加入、加入0.2ml 10% sds 溶液，再加入溶液，再加入10l 20 mg/ml 蛋白酶蛋白酶k， 37水浴中温育水浴中温育1h。(sds溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，sds 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶k能水解消化蛋白质，特别是与dna结合的组蛋白。)4、取出离心管，加入、取出离心管，加入0.2ml 5mol/l nacl 溶液，混匀后再加入溶液，混匀后再加入0.2ml ctab/nacl 溶液，溶液，65水浴中温育水浴中温育20min。5、加入与菌液等体积（

6、、加入与菌液等体积（1.6ml）的苯酚）的苯酚/氯仿氯仿/异戊醇混合液，异戊醇混合液，用漩涡混合器混匀，用漩涡混合器混匀，4000r/min离心离心10min。注意吸取混合液。注意吸取混合液前将混合液充分振荡混匀。前将混合液充分振荡混匀。6、取上层水相至无菌离心管，再加入等体积的氯仿、取上层水相至无菌离心管，再加入等体积的氯仿/异戊醇混异戊醇混合液，用移液器反复吹打混匀，合液，用移液器反复吹打混匀，4000r/min离心离心10min。7、将上层水相转移到另一个无菌离心管中，加入、将上层水相转移到另一个无菌离心管中，加入2l rnase a，37水浴中温育水浴中温育30min。8、加入等体积的

7、氯仿和异戊醇混合液，充分振荡，、加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，充分振荡，抽提残留在水相中的苯酚。抽提残留在水相中的苯酚。4000r/min离心离心10min。9、将上清液移至新的离心管中。、将上清液移至新的离心管中。10、加入上清液、加入上清液1/10体积的体积的3mol/l naac溶液，以及溶液，以及上清液上清液2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀以沉淀倍体积的无水乙醇，颠倒混匀以沉淀dna。室温下静置室温下静置10min，dna形成白色（或淡黄色）絮状形成白色（或淡黄色）絮状沉淀。沉淀。11、用移液器轻轻吸住白色絮状沉淀，将其转移到装、用移液器轻轻吸住白色絮状沉淀，将其转移到装有适量有适量75

8、%乙醇的乙醇的1.5ml离心管中。上下颠倒漂洗，离心管中。上下颠倒漂洗，洗去杂质。洗去杂质。7500r/min离心离心5min。12、去上清液，沉淀干燥后溶解于、去上清液，沉淀干燥后溶解于100l te中。中。 取取10l提取的基因组提取的基因组dna溶液加溶液加1.99ml水稀水稀释后测量释后测量od260，蒸馏水作为空白，计算，蒸馏水作为空白，计算dna产量产量（1 od26050g dna/ml）。）。 - -20贮存其余基因组贮存其余基因组dna，待下一实验用作，待下一实验用作pcr反应的模板。反应的模板。 dnadna产量测定产量测定 试 剂1、te：10mmol/l trishcl

9、，1mmol/l edta2、ctab（十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵）/ nacl：将将4.1g nacl溶解溶解 于于80ml水中，缓慢加入水中，缓慢加入10g ctab，定容至，定容至100ml。3、苯酚苯酚/氯仿氯仿/异戊醇混合液：异戊醇混合液：水饱和酚水饱和酚 : 氯仿氯仿 : 异戊醇异戊醇 = 25 : 24 : 1（体积比）。（体积比）。4、氯仿氯仿/异戊醇混合液：异戊醇混合液：氯仿氯仿 : 异戊醇异戊醇 = 24 : 1（体积比）。（体积比）。5、10g/l rnase a 10% sds 20 mg/ml 蛋白酶蛋白酶k 5mol/l nacl 3mol/l naa

10、c 无水乙醇无水乙醇 75%乙醇乙醇。第三部分 pcr扩增组组 分分 剂剂 量（量（l） 基因组基因组dna模板模板10-100ng10taq buffer34dntp（各（各10mol/l）0.5上游引物（上游引物（hex标记）标记）1下游引物（下游引物（hex标记）标记）1taq dna聚合酶聚合酶(2.5u/l)0.5dh2o（随模板体积变化）（随模板体积变化）pcr反应程序阶段阶段起始变性起始变性变性变性退火退火延伸延伸最后延伸最后延伸温度温度9494607272时间时间 3min 30s30s45s10min 循环循环30次次 第四部分基因芯片杂交和检测每个阵列的探针排布标记有标记有

11、hex的核酸的核酸（无标记的大肠杆菌（无标记的大肠杆菌hsp70基因扩增产物）基因扩增产物）（无标记的黄单胞菌（无标记的黄单胞菌htpg基因扩增产物）基因扩增产物）50%dmso器器材材耗耗材材软软件件实验步骤（1）准备芯片：去掉杂交围栏上的胶纸，将杂交围）准备芯片：去掉杂交围栏上的胶纸，将杂交围栏放在杂交模具中心的同样形状的凹槽中，胶面朝栏放在杂交模具中心的同样形状的凹槽中，胶面朝上，注意要使杂交围栏与凹槽契合。用手捏着芯片上，注意要使杂交围栏与凹槽契合。用手捏着芯片上贴有标签纸的一端，将芯片另一端顶着模具的顶上贴有标签纸的一端，将芯片另一端顶着模具的顶端，然后将芯片正面（贴有标签纸）朝下放

12、入模具。端，然后将芯片正面（贴有标签纸）朝下放入模具。在芯片背面相应位置用镊子轻轻向下按，使杂交围在芯片背面相应位置用镊子轻轻向下按，使杂交围栏紧贴在芯片上。栏紧贴在芯片上。撕去围栏上的保护纸 贴 围 栏第四部分 实验步骤（2）往杂交盒底部凹槽中均匀加入少量蒸馏水（约）往杂交盒底部凹槽中均匀加入少量蒸馏水（约200l），以防止杂交过程中杂交液大量挥发。把），以防止杂交过程中杂交液大量挥发。把芯片有杂交围栏的一面朝上放入杂交盒中，按芯片芯片有杂交围栏的一面朝上放入杂交盒中，按芯片摆放方向盖上盖片，注意使盖片上的凸面朝下。摆放方向盖上盖片，注意使盖片上的凸面朝下。盖片盖片芯片芯片标签端标签端盖片正

13、面观盖片正面观往杂交盒底部的凹槽中加水将贴好围栏的芯片放入杂交盒注意：围栏朝上注意：围栏朝上盖上盖片注意：盖片的凸起面向下注意：盖片的凸起面向下第四部分 实验步骤（3）杂交：将杂交液用移液器混匀后）杂交：将杂交液用移液器混匀后3000r/min离离心心30s，95热变性热变性3min。冰浴骤冷。冰浴骤冷1min。用移液。用移液器将杂交液注入盖片上的小孔。盖上器将杂交液注入盖片上的小孔。盖上杂交盒的盖杂交盒的盖板，两侧用两个卡子扣上，确保杂交盒的密封性。板，两侧用两个卡子扣上，确保杂交盒的密封性。在在42水浴中杂交水浴中杂交2小时。小时。加杂交液盖上盒盖，插上卡子放入恒温水浴中保温第四部分 实验

14、步骤（4）清洗：）清洗：洗液先预热至洗液先预热至42。将芯片转移到盛将芯片转移到盛放洗液的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上放洗液的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗。依次在洗液清洗。依次在洗液、中各清洗中各清洗4分钟。然后放分钟。然后放在在50ml锥形离心管中（标签纸端朝下），锥形离心管中（标签纸端朝下），1500 r/min离心离心1分钟以除去芯片表面的水分。分钟以除去芯片表面的水分。（5）扫描及结果测定：启动微阵列芯片扫描仪系扫描及结果测定：启动微阵列芯片扫描仪系统，进行芯片扫描，保存检测结果。统，进行芯片扫描，保存检测结果。 清洗清洗甩干甩干基因芯片扫描仪微阵列芯片扫描仪微阵列芯片扫描仪ecoscanecoscan100100基因芯片扫描仪工作原理基因芯片扫描仪工作流程软件界面按钮区按钮区状态栏状态栏图象显示区图象显示区控制区控制区大肠杆菌的检测结果黄单胞菌的检测结果试 剂（1 1）2020sscssc：在在800ml800ml水中溶解水中溶解175.3g nacl175.3g nacl和和88.2g88.2g柠柠檬酸钠，加入数滴檬酸钠，加入数滴hclhcl溶液