A细胞工程第2节—原生质体培养和体细胞杂交3

1、第六章植物原生质体培养和第六章植物原生质体培养和体细胞杂交体细胞杂交陈观水陈观水生命科学学院生命科学学六章第六章 植物原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体培养和体细胞杂交 主要内容：主要内容： 第一节第一节 原生质体的分离和纯化原生质体的分离和纯化 第二节第二节 原生质体培养原生质体培养 第三节第三节 植物体细胞杂交植物体细胞杂交 学习的目标与要求：学习的目标与要求： 掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解原生质分离掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解原生质分离方法，原生质纯化方法和活力测定方法。掌握原生质体融方法，原生质纯化方法和活力测定方法。掌握原生质体融合概念、介

2、绍原生质体融合方法，了解杂种细胞的筛选、合概念、介绍原生质体融合方法，了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种植株的鉴定方法。鉴定和杂种植株的鉴定方法。植物原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体培养和体细胞杂交 原生质体的概念原生质体的概念 植物原生质体植物原生质体(protoplast):指将植物细胞壁去掉后得到指将植物细胞壁去掉后得到的裸露的球形细胞的裸露的球形细胞原生质体的特性原生质体的特性u去壁的原生质体容易实现外源遗传物质的导入和吸收。去壁的原生质体容易实现外源遗传物质的导入和吸收。u原生质体具有细胞全能性。原生质体具有细胞全能性。u不同来源的原生质体具有彼此融合的能力。不同来源的原生质体具有彼

3、此融合的能力。原生质体培养原生质体培养 将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进行经过培养成完成植株使其再生细胞壁，进行经过培养成完成植株植物原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体培养和体细胞杂交原生质体原生质体植物原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体培养和体细胞杂交原生质体的生物学意义原生质体的生物学意义细胞细胞原生质体原生质体酶解酶解体细胞体细胞融融 合合遗传转化遗传转化共培养共培养显微操作显微操作基因枪基因枪导导 入入原生质体培原生质体培 养养细胞细胞培养培养愈伤组织诱愈伤组织诱 导导再生植株再生植株植物原生质体培养和体

4、细胞杂交植物原生质体培养和体细胞杂交 体细胞杂交体细胞杂交(somatic hybridization) 又称为原生质体融合又称为原生质体融合(protoplast fusion),是指在人工控是指在人工控制条件下，不经过有性过程，两种制条件下，不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种体细胞原生质体相互融合产生杂种细胞，并使之分化再生细胞，并使之分化再生,形成新物种形成新物种或新品种的技术。或新品种的技术。植物原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体培养和体细胞杂交植物细胞的融合过程植物细胞的融合过程植物原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体培养和体细胞杂交1978年德国科学家年德国科学家

5、梅歇尔斯等人把马铃薯梅歇尔斯等人把马铃薯(potato)和番茄和番茄(tomato)的原生质体融合获得了的原生质体融合获得了体细胞杂种体细胞杂种“泡马豆泡马豆”（pomato)一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离原生质体的分离1)材料来源材料来源植物幼嫩的叶片植物幼嫩的叶片无菌实生苗的子叶和下胚轴无菌实生苗的子叶和下胚轴外植体来源的愈伤组织和悬浮细胞系外植体来源的愈伤组织和悬浮细胞系花粉细胞花粉细胞2)材料的预处理材料的预处理 用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。高某些材料原生

6、质体的产量和活力。一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离原生质体的分离3)酶的种类及酶液配制酶的种类及酶液配制 原生质体分离常用的商品酶原生质体分离常用的商品酶一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离原生质体的分离4)分离方法分离方法原生质体分离的方法原生质体分离的方法机机 械械 分分 离离 法法酶酶 解解 分分 离离 法法一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离原生质体的分离4)分离方法分离方法一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离原生质体的分离4)分离方法分离方法 机械分离法：机械分

7、离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。 缺点：缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。产生原生质体的植物种类受到限制。 优点：优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离原生质体的分

8、离4)分离方法分离方法 酶解分离法：酶解分离法： 指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。获得大量有活力的原生质体的方法。 常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶崩溃酶driselase）、果胶酶类（果胶酶和离析酶）、果胶酶类（果胶酶和离析酶macerozyme）、蜗牛酶和胼胝质酶。）、蜗牛酶和胼胝质酶。一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的

9、分离原生质体的分离4)分离方法分离方法酶解分离法酶解分离法 优点：获得量大，适用广泛。优点：获得量大，适用广泛。 缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质会影响所获原生质体的活力以及酚类物质会影响所获原生质体的活力一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离原生质体的分离4)分离方法分离方法酶解分离法酶解分离法一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离原生质体的分离4)分离方法分离方法principle steps in enzymatic isolation一、原生质体的分离和纯

10、化一、原生质体的分离和纯化2.原生质体的纯化原生质体的纯化 1)过滤过滤-离心法离心法 2)漂浮法漂浮法 3)界面法界面法一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化2.原生质体的纯化原生质体的纯化1)过滤过滤-离心法离心法 利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。部。 优缺点：优缺点： 纯化原生质体比较简单。纯化原生质体比较简单。 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互由于原生质体沉积于试管底部，造成相互 挤压，常挤压，常引起原生质体的

11、破碎。引起原生质体的破碎。一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化2.原生质体的纯化原生质体的纯化2)漂浮法漂浮法 采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、percoll、ficoll），使原生质体漂浮在液体表层的纯），使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。化方法。 优点：优点：(1)可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损。撞击而破损。(2) 所用药品简单，成本低。所用药品简单，成本低。 缺点及补救措施：缺点及补救措施：对离心力要求比较严格，掌握不好，对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。可

12、采用不同浓度和不同离心速原生质体则不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。度分次漂浮的方法。飘浮法飘浮法protoplast一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化2.原生质体的纯化原生质体的纯化3) 界面法界面法 又称又称不连续梯度法不连续梯度法，采用两种密，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。原生质体的方法。 优点：优点：可以收集到数量较大的纯可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程净原生质体，同时避免

13、收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。中原生质体因相互挤压而破碎。一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化2.原生质体的纯化原生质体的纯化 加培养基使原加培养基使原生质体密度为生质体密度为104106/ml原生质体混合液原生质体混合液收集滤液收集滤液去上清去上清洗液重悬洗液重悬原生质体原生质体 培培 养养 基基 重悬原生质体重悬原生质体去上清去上清40-100m 过滤过滤500rpm1-5 min500rpm1-5 min重复重复3次次500rpm1-5 min去上清去上清重复重复3次次一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化3.原生质体活力测定原生质体活力测定1)形态识别形态识

14、别 形态完整、富含细形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，球形，放入低渗溶液中，可正常膨大。可正常膨大。一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化3.原生质体活力测定原生质体活力测定2)染色法染色法荧光显微镜识别荧光显微镜识别(fda法法)：fda (fluorescein diacetate) 本身不本身不发荧光也不具有极性，能自由发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内穿过细胞质膜。活细胞内fda可以被酯酶裂解，将能发荧光可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分释放出来。荧光素的极性部分释放出来。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整则不能自由穿

15、越质膜，在完整的活细胞内积累。的活细胞内积累。使用浓度：使用浓度：0.01%一、原生质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化3.原生质体活力测定原生质体活力测定2)染色法染色法 酚藏花红染色法（酚藏花红染色法（0.1%) )：酚藏花红能酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。的原生质体不着色。 伊凡蓝伊凡蓝(evans blue)染色法染色法( (0.025%) )：有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。取这种染料，活细胞不摄取。 细胞质环流法和氧电极法细胞质环流法和氧电极法一、原生

16、质体的分离和纯化一、原生质体的分离和纯化4.影响原生质体数量和活力的因素影响原生质体数量和活力的因素u供试材料的基因型和外植体供试材料的基因型和外植体u酶的种类、浓度与酶解时间酶的种类、浓度与酶解时间u渗透压稳定剂渗透压稳定剂u质膜稳定剂质膜稳定剂u酶解方式酶解方式uphu湿度和光照湿度和光照二、原生质体培养二、原生质体培养 原生质体培养原生质体培养 获得有活力的原生质体后，应用合适的方法，在适当获得有活力的原生质体后，应用合适的方法，在适当的培养条件下，可使原生质体再生出新的细胞壁，接着细的培养条件下，可使原生质体再生出新的细胞壁，接着细胞进行持续分裂形成细胞团，并培养形成愈伤组织或胚状胞进

17、行持续分裂形成细胞团，并培养形成愈伤组织或胚状体，分或或发育成苗，最后形成完整的再生植株。体，分或或发育成苗，最后形成完整的再生植株。 原生质体培养的意义原生质体培养的意义u建立单细胞无性系建立单细胞无性系u用于原生质体融合用于原生质体融合u遗传转化的良好受体遗传转化的良好受体u多种基础理论研究的实验材料多种基础理论研究的实验材料二、原生质体培养二、原生质体培养1.原生质体培养方法原生质体培养方法二、原生质体培养二、原生质体培养1.原生质体培养方法原生质体培养方法 1)液体浅层培养液体浅层培养 优点：优点：原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能

18、力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点：缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。察某一个细胞的发育情况。二、原生质体培养二、原生质体培养1.原生质体培养方法原生质体培养方法 2)固体平板培养固体平板培养 优点：优点：使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮使原生

19、质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。的全过程进行定点观察。 缺点：缺点： 培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟细胞分裂时间会推迟2d左右。左右。二、原生质体培养二、原生质体培养1.原生质体培养方法原生质体培养方法 3)液体液体-固体双层培养法固体双层培养法 优点：优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢放

20、到液体培养基固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。裂和细胞团的形成。 缺点：缺点：不易观察细胞的发育过程不易观察细胞的发育过程。 二、原生质体培养二、原生质体培养2.植株再生过程植株再生过程 植株植株(原生质体原生质体)再生过程是指分离、纯化的原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质体在适当的培养方法和良好的培养条件下，很快恢复细胞壁，在适当的培养方法和良好的培养条件下，很快

21、恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织或通再生细胞持续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分化出完整植株的过程。过胚状体分化出完整植株的过程。u细胞壁再生细胞壁再生u细胞分裂细胞分裂u植株再生植株再生二、原生质体培养二、原生质体培养2.植株再生过程植株再生过程 细胞壁再生细胞壁再生 再生所需时间与植物种类和起源细胞的分化程度及生再生所需时间与植物种类和起源细胞的分化程度及生理状态有关。理状态有关。 再生过程：先是质膜合成细胞壁主要成分微纤维，然再生过程：先是质膜合成细胞壁主要成分微纤维，然后在质膜表面进行聚合作用，形成多片层的结构，以后在后在质膜表面进行聚合作用，

22、形成多片层的结构，以后在质膜和片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不质膜和片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁。定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁。细胞壁再生是细胞分裂的先决条件细胞壁再生是细胞分裂的先决条件二、原生质体培养二、原生质体培养2.植株再生过程植株再生过程 细胞分裂细胞分裂 植株再生植株再生 植株再生有两种途径：植株再生有两种途径： 通过愈伤组织诱导器官形成途径通过愈伤组织诱导器官形成途径 通过诱导胚状体途径通过诱导胚状体途径二、原生质体培养二、原生质体培养3.影响原生质体培养的因素影响原生质体培养的因素u材料材料u培养基培养基u渗透

23、压稳定剂渗透压稳定剂u原生质体的培养密度原生质体的培养密度u培养条件培养条件二、原生质体培养二、原生质体培养原生质体的分离培养与植株再生原生质体的分离培养与植株再生(动画动画)二、原生质体培养二、原生质体培养4. 原生质体培养的操作实例原生质体培养的操作实例7a: 7a: 分离原生质体分离原生质体1010天后第天后第1 1次分裂次分裂7b,c:27b,c:2和和3 3周龄小细胞团周龄小细胞团 7d,e: 47d,e: 4和和6 6周龄小愈伤组周龄小愈伤组织织 7f: 7f: 转到转到 b5h b5h 培养基前培养基前8 8周周龄小愈伤组织龄小愈伤组织 8a: 8a: 转到转到 b5h b5h

24、培养基上的培养基上的小愈伤组织和体细胞胚诱小愈伤组织和体细胞胚诱导导 8b: 8b: 转到转到 boi2y boi2y 培养基上培养基上的球形胚的球形胚 8c: 8c: 转到转到msms培养基上的子叶培养基上的子叶期胚以转化为小植株期胚以转化为小植株 紫花苜蓿叶片原生质体分裂、克隆体的发育紫花苜蓿叶片原生质体分裂、克隆体的发育及通过体细胞胚再生小植株及通过体细胞胚再生小植株 三、植物体细胞杂交三、植物体细胞杂交原生质体的分离与培养原生质体的分离与培养( (动画动画) )三、植物体细胞杂交三、植物体细胞杂交体细胞杂交体细胞杂交 两种异源（种、属间）原生质体，两种异源（种、属间）原生质体，在人工控

25、制条件下，相互接触从而发生在人工控制条件下，相互接触从而发生膜融合，胞质融合和核融合并形成杂种膜融合，胞质融合和核融合并形成杂种细胞的过程。细胞的过程。体细胞杂交的意义体细胞杂交的意义u实现远缘杂交，形成新的物种实现远缘杂交，形成新的物种u创造细胞质杂种创造细胞质杂种u培育作物新种质和新品种培育作物新种质和新品种三、植物体细胞杂交三、植物体细胞杂交生物种类生物种类细胞来源细胞来源成功年代成功年代烟草两个种间苷蓝青菜大豆马唐草矮牵牛龙面花大麦花生大麦大豆小麦矮牵牛油菜大豆玉米大豆大豆野豌豆大麦蚕豆大豆草香木犀酵母菌鸡大豆烟草大豆秋水仙番茄马铃薯叶叶叶根愈伤组织叶叶花瓣种子种子叶悬浮细胞叶花瓣叶悬

26、浮细胞叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶根悬浮细胞叶原生质体血红细胞悬浮细胞叶悬浮细胞叶叶根尖1972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972三、植物体细胞杂交三、植物体细胞杂交1.原生质体融合的类型原生质体融合的类型 1)自发融合自发融合 同种细胞在培养时同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；发融合； 2)诱发融合诱发融合 指将植物原生质体制备出来后，再加入诱导剂或用其指将植物原生质体制备出来后，再加入诱导剂或用其他方法促使两亲本原生质体融合的方法。他方法促使两亲本原生质体融合的方法。三、植物体细胞杂交三、植物体细胞杂交1.原生质体融合的类型原生质体融合的类型(动画动画)三、植物体细胞杂交三、植物体细胞杂交2.原生质体融合的方法原生质体融合的方法 1)化学诱导融合化学诱导融合 利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。的方法。u无