骨形成蛋白微球温敏性凝胶复合系统的制备及释药特性研究

1、文档来源为 :从网络收集整理.word 版本可编辑.欢迎下载支持骨形成蛋白微球温敏性凝胶复合系统的制备及释药特性研究 符旭东1,刘宏，汤韧，张孟佑(广州军区武汉总医院药剂科，武汉， 430070 ) 摘要 目的 考察了处方和制备工艺对人重组骨形成蛋白2 (rhbmp-2)微球释放度的影响，并比较bmp微球和bmp微球温敏性凝胶复合系统的体外释药特性。方法采用w/o/w型乳化溶剂挥发法以聚乳 酸-乙醇酸共聚物(plga)为材料制备空白微球，通过吸附 法制备rhbmp-2载药微球。以单甲基聚乙二醇羟基乙酸共聚物( mpeg-plga )为材料 制备凝胶，采用夹心法酶联免疫吸附法测定释药速度。结果微

2、球呈现三相释药模式，而微球凝胶剂体外释药曲线符合higuchi方程。采用 plga-cooh制备的rhbmp-2微球，其突释明显小于以plga为材料制备的微球，增加内水相与油相 的体积比、在内水相中加入氯化钠均可以在一定程度上减小突释。结论bmp微球温敏性凝胶复合系统制备工艺，具有比 rhbmp-2微球剂更理想的体外释药特 性。关键词：人重组骨形成蛋白-2;聚乳酸-乙醇酸共聚物；单甲基聚乙二醇-羟基乙酸共聚 物；微球；温敏性凝胶；突释preparation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 loaded microspheres

3、/ thermosensitive hydrogels complex and its in vitro release characteristicfu xu-dong , liu hong , tang ren, zhang meng-you (wuhan general hospital of guanzhou command wuhan 430030, china)abstract : objective to examine the effects of formulation factors on in vitro release rate of recombinant human

4、 bone morphogenetic protein-2 (rhbmp-2) 1基金项目：湖北省科技攻手计划 (2005aa301c38通讯作者：符旭东，女，副主任药师 tel/fax:(027) e-mail:fuxudong2005loaded microspheres and compare drug release profiles of microspheres and microspheres/ thermosensitive hydrogels complex. methods blank microspheres were prepared with w/o/w emulsi

5、on solvent evaporation method.rhbmp-2 loaded microspheres was prepared with absorption method. thermosensitive hydrogels were prepared with mpeg-plga.enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine drug content and in vitro release rater. esults the profiles of rhbmp-2 microspheres were char

6、acterized by three phase, while the in vitro release profile of rhbmp-2 microspheres/ thermosensitive hydrogels complex conformed to higuchi equation. the amount of rhbmp-2 released from microspheres in the initial burst phase was decresed markedly when plga-cooh was used to prepare microspheres ins

7、tead of plga. increasing the volume ratio of internal aqueous and adding nacl to internal aqueous phase could reduce initial releaseconclusion rhbmp2 -loaded microspheres/ thermosensitive hydrogels complex exerted a desirable release characteristic.key words recombinant human bone morphogenetic prot

8、ein-2; plga; mpeg-plga; thermosensitive hydrogels; microsphere； initial burst release牙周病是世界卫生组织列为重点防治的、人类普遍罹患的口腔疾病之一，是成年人失牙的主要原因， 其治疗的最终目标是实现牙周组织包括牙槽骨、 牙骨质 和牙周膜的完全功能性再生，而牙周组织再生的基础是牙周膜细胞( pdlcs) ， 但在牙周损伤部位pdlcs 的来源非常有限，以致牙周组织很难达到有效地再生和重建。骨形成蛋白( bone morphogenetic protein ,bmp )是目前发现的唯一能在体内诱导骨与软骨的细胞因子

9、，业已证实bmpfg够促进pdlc5曾殖及牙周组 织的修复 1 ，但是 bmp 在体内温度和酶的作用下非常容易代谢失活，限制了其发展和应用。寻找适宜的药物递送系统一直是bmp勺研究热点之一，以生物可降解材料制备的微球或纳米粒制剂作为bmp牙周袋局部治疗的载体受到研究者的青睐， 但是这种给药系统体外释药曲线并不是非常理想， 表现出一定的突释或不 规则的三相释药模式23 ，而且微粒制剂用于牙周袋局部给药还存在使用不便等缺点。笔者以聚乳酸-乙醇酸共聚物为材料制备 bmp散球，通过处方和工艺的优 化在一定程度上可降低突释；将制备的微球分散在以聚乙二醇单甲醚/聚乳酸-乙醇酸共聚物（ mpeg-plga

10、） 为材料制备的凝胶中， bmp 在微球凝胶复合系统中的释药速度得到进 一步改善 。 mpeg-plga 具有温敏性 ， 一定浓度的 mpeg-plga 水溶液在室温下为自由流动的液态可以方便医生用药， 在体温下可 发生胶凝而起到控制药物释放的作用。本文主要报道了处方和制备工艺对bmp微球以及 bmp 微球凝胶剂体外释药曲线的影响。 1 材料和仪器骨形成蛋白（北京环亚泰克生物医学技术有限公司） ；聚（乳酸乙醇酸）共聚物50/50 （plga乳酸：乙醇酸比例为50:50,分子量为10000,山东省医 疗器械研究所）；端竣基聚乳酸羟基乙酸共聚物（plga-cooh，酸：羟基乙酸 比例为 50:50

11、, 分子量为 10000， 山东省医疗器械研究所） ， 聚乙烯醇（pva 124，日产进口分装，北京化学试剂公司） ； mpeg-plga （la:ga:eo 的比例是 8： 2： 1，分子量4000-5000， peg 分子量1000，济南岱罡生物技术有限公司）； bmp-2elisa试剂盒（武汉博士德试剂公司）。数显式电动搅拌器 （上海司乐仪器有限公司） ； jy9202d 超声波细胞粉碎机 （宁波新芝生物科技股份有限公司） ； sk 1 快速混匀器 （常州国华电器有限公司） ； uv-260 型紫外分光光度计 （日本岛津公司） ； shz 82恒温振荡器 （常州国华电 器有限公司） ；

12、bx-50 光学显微镜 （日本 olympus 公司） ； s 450 扫描电镜 （日 本 hitachi 公司） ； alpha1-4 冷冻干燥机（ christ, 德国） 。2 实验方法2.1 bmp 微球的制备空白微球采用 w/0/w乳化溶剂挥发法制备，取适量水加入到2ml含有200mg plga勺二氯甲烷中，冰浴条件下超声 30s,然后将其倒入15ml 3 %的pva溶液 中，冰浴条件下600rpm搅拌10min后，将转速降至300rpm加入35ml水，在室 温下继续搅拌4h,然后过滤，洗涤，真空五氧化二磷干燥 48h。bmpt球通过吸附法载药，将10mg空白微球混悬在100d含50闻

13、ml-1的 bmp2.5%甘氨酸缓冲液中，4c下吸附24h后冷冻干燥。2.2 bmp 微球凝胶的制备称取 mpeg-plga 4g 置于 20ml 水中，搅拌后静置于4冰箱中，并时时振荡，待mpeg-plga充分溶胀后，即得20%mpeg-plga水凝胶。取10mg载 药微球，加入2.5ml凝胶，在冰浴条件下充分混匀，即得含 bmp 2仙g ml-1的微 球凝胶。2.3 bmp 微球及微球凝胶剂体外释放度的测定 4将载有5仙bmp的微球分别混旋在2.5ml的0.1mol l-1 ph7.4的磷酸盐缓冲 液、 10和 20的 mpeg-plge 水溶液中，精密量取0.1ml 分别置于 1ml 的

14、离心管中， 加入 1 ml ph7.4 的磷酸盐缓冲液， 置于恒温振荡器中， 振荡速度为 100r ?min-1、温度为（37±1） c,分别在 0.5h、1、3、5、7、14、21 和 28d 取样， 2000rpm离心10min后，弃掉上清夜，沉淀物中加入1mlpbs,超声15min,2000rpm 离心 10min 后， 取上清液 0.lml 按 1:10 比例稀释后， 采用夹心法酶联免疫吸附法测定样品中残留的药物， 通过标准曲线计算bmp 的含量， 该方法的检测范围 62.5-4000pg/ml,每份样品平行测定2次。释放度为释放前后系统中的药物含量之 差与释放前系统的药物含

15、量的百分比。2.4 微球粒径及表面形态观察用光学显微镜及扫描电镜观察微球的外观形态，测定不少于 200 个的粒径， 计算算术平均粒径。 3 结果与讨论3.1 内水相与油相的体积比对bmp 微球初始释药行为的影响以plga50/50为材料，考察当内水相与油相的体积比分别为1:5、1:10和1:20时微球的形态和释药行为。 如图 1 所示， 随着内水相与油相的体积比的增加， 微 球的粒径没有明显的变化（大约在 2030而，但是微球表面的孔洞增加5,微 球在0.5h3d的释放度降低。这可能因为 bmp!通过吸附作用载药的，随着内 水相体积相对减少，微球内部和表面的孔洞减少（见图2）,微球与bmp容液

16、接触面积减少，bmp被吸附的量减少，没有被吸附的 bmps释药初期很快扩散到释 放介质，微球的突释增加。4文档来源为：从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持80两度放释积累4000.52472t/h口内水相：油相1 : 5内水相：油相1 : 10 口内水相：油相1: 20图1内水相与油相的体积比对 bmp微球072h释药行为的影响图2内水相与油相的体积比对 bmp微球形态的影响内水相和油相的体积比 a 1 :5 b 1 :10 c 1 :203.2 内水相中氯化钠含量对bmp微球初始释药行为的影响将内水相与油相的体积比固定在1:5,用10%的氯化钠溶液替代水作为内水 相，可以发现微球

17、表面的孔洞明显增加（如图 3所示），因为随着内水相渗透压 增高，外相的水更容易进入微球的内部，表面的孔洞明显增加（见图4）,和“3.1 项下观察到的结果相似微球在 0.5h3d的释放度显著降低。这可能同样是因为 bmp1通过吸附载药，微球内部和表面的孔洞为bmp容液的渗透提供了很多的通道，有利于药物的吸附口未加naclt/ 含10%氯化钠o图3内水相中氯化钠含量对bmp微球072h释药行为的影响bmp微球形态的影响图4内水相与油相的体积比对a内水相中未加氯化钠b内水相中含10%氯化钠3.3 plga及plga-cooh 对bmp微球释放度的影响如图5所示，采用plga-cooh备的微球在0.5

18、h3d的释放度明显低于plga 微球，这是因为bmp1一种碱性蛋白（等电点在 9.0左右），可与plga-cooh 子链中的竣基可以发生离子相互作用而使 bmpm附量增加6,因此plga-cooh 球中未吸附的bmp®少，突释明显降低。60外度放释积累50403020100 10.52472t/hli plga plga-cooh图5 plga种类对bmp微球072h释药行为的影响3.4 mpeg-plga浓度对微球凝胶剂中bmp释放度的影响如图6所示，bmp微球表现出三相释药模式7:01d的快速释放期。这 是由于表面未吸附药物快速溶解所导致的，约有30%左右的药物释放；第1d 5d

19、的时滞期药物释放速度非常缓慢，这是因为吸附于微球表面的药物已经释放 完毕，而plga的降解速度较慢，分子量为12.1kda的bmp很难从微球中扩散 出来；第5d14d后释药速度明显加快，是由于随着 plga逐渐降解成水溶 性小分子，微球内部和表面的孔隙增大，为药物的扩散提供了更多通道。bmp微球凝胶剂没有表现出明显的三相释药模式，体外曲线符合higuichi方程，q 15.542d 6.6631 r=0.9884。其突释明显低于微球剂，而在15d的释药速度 又略快于微球剂，可能是混悬在凝胶中的微球就像是包上了一层衣，高粘度的凝胶层，降低了微球上未被吸附的bmp向介质扩散的速度。bmp微球凝胶剂

20、在5 14d也没有像微球剂那样呈现快速释放的特征， 这是因为凝胶层阻止了水分的渗 透，plga降解速度减慢所致。t/dt微球tl微球凝胶”度放释积累图6 mpeg-plga浓度对bmp微球释药曲线的影响4结论本文比较了 bmp散球和bmp散球凝胶剂的体外释药特征，同时还考察了处方 和制备工艺对bmpk药微球释放度的影响。研究表明bmpt球呈现三相释药模式， 而bmp散球凝胶剂体外释药曲线符合 higuchi方程，控释效果更理想。研究结果 还显示采用plga-cooh备的bmp散球，其突释明显小于以 plgaj材料制备的 微球，增加内水相与油相的体积比、在内水相中加入氯化钠均可以在一定程度上 减

21、小突释。参考文献1赵征，张广耘.bfgf和rhbmp对牙周膜细胞增殖和胶原酶水平的影响d.青 岛：青岛大学，2002.2 schrier ja.,deluca pp. recombinant human bone morphogenetic protein-2 bingding and incorporation in plga microsphere delivery systemsjpharm develop and tech1999,4(4):611621.3 schrier ja.,deluca pp.porous bone morphogenetic protein-2 microspheres: polymer binding and in vitro releasej. aaps pharmscitech 2001,2(3) article174 chung yong