微生物的培养与分离一轮学案

1、微生物的分离和培养【考纲要求】 微生物的分离和培养 B 【复习要求】1.理解培养基对微生物的选择利用并能利用选择培养基分离微生物2.掌握培养微生物的过程、条件和方法3.掌握测量微生物数量的方法、统计菌落数量的方法4.能利用选择培养基分离微生物的方法 【基础知识】一、微生物的实验室培养1培养基 （1）概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。（2）成分：一般都含有碳源、氮源、水和无机盐，还需满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。营养要素来源功能碳源无机氮源CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳无机物构成细胞中的物质和一些代谢产物；既是碳源又是能源有机

2、碳源糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等氮源无机氮源无机氮：NH3、铵盐、硝酸盐、N2等将无机氮合成含氮的代谢产物有机氮源牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物生长因子维生素、氨基酸、碱基酶和核酸的组成成分；参与代谢过程中的酶促反应（3）分类和应用划分标准培养基种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂，如琼脂观察微生物的运动、分类、鉴定 培养基微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种化学成分 培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产 培养基培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成)分类、鉴定用途 培养基培养基中加入某种化学物质，以

3、抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物(如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入 ；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度 ) 培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物，如可用添加 的培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)2无菌技术 消毒和灭菌的区别条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分对人有害的微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法牛奶等化学药剂、物理消毒法用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源；紫外线消毒灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，

4、包括芽孢和孢子灼烧灭菌法接种工具_灭菌法玻璃器皿、金属工具_灭菌法培养基及容器的灭菌三种常用灭菌方法的比较灭菌方法适用材料或用具灭菌条件灭菌时间灼烧灭菌接种环、接种针、涂布器或其他金属工具酒精灯火焰的充分燃烧层直至烧红干热灭菌玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等干热灭菌箱内， 1 h2 h高压蒸汽灭菌培养基等高压蒸汽灭菌锅内 kPa， 15 min30 min3实验操作(1)牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备计算称量熔化灭菌倒平板。(2)微生物的分离方法： 划线法 平板法微生物的计数方法： 方法平板划线法稀释涂布平板法注意事项(1)接种环的灼烧：第一次划线前：接种环上的微生物，避免污染培养物每次划线

5、前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自_划线末端划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者(2)灼烧接种环之后，要_后再进行操作，以免温度太高杀死菌种(3)划线时最后区域不要与第_区域相连(4)划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基_。(1)稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应离火焰12 cm处(2)涂布平板时：涂布器用体积分数为70%酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任何物体目的在培养

6、基上形成由单个菌种繁殖而来的子细胞群体菌落培养平板冷凝后 培养，使培养基表面的水分更好地挥发，防止皿盖上水珠落入培养基造成污染。二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1分离原理：土壤中细菌之所以能分解尿素，是由于它们体内能合成脲酶 ，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中 起到催化作用。2菌种筛选：使用_是唯一氮源的_培养基培养。3统计菌落数目：常用方法有 、显微镜直接计数法。直接计数法：这种方法是利用血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点是不能区分死菌与活菌。（但用亚甲基蓝染色后，死细胞是蓝色，活的是无色的）间接计数法(活菌计数法)：稀释涂布平板法，常用来统计样品中

7、的活菌数。此法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的。4实验流程：土壤取样制备培养基微生物的培养与观察细菌的计数。5观察记录结果：每克土壤样品菌数某稀释倍数的菌落平均数×稀释倍数。思考：如何进行系列稀释？某稀释倍数指哪一个倍数？计算值和真实值之间的关系？为什么？6.鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂， 若pH升高，指示剂变 ，说明细菌能分解尿素。三、分解纤维素的微生物的分离1纤维素酶：一种复合酶，它包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。2纤维素分解菌的筛选原理 刚果红可以与纤维素形成红色复

8、合物，但并不和二糖和葡萄糖发生这种反应。纤维素分解菌能产生纤维素酶分解纤维素，从而使菌落周围形成透明圈。3. 筛选方法：(1) 鉴定方法： 染色法，即通过是否产生_来筛选纤维素分解菌。(2) 筛选：以 为唯一碳源的选择培养基。4土壤中纤维素分解菌的筛选实验流程土壤取样（富含 的环境）选择培养（用_培养基培养，目的是增加纤维素分解菌的数量）梯度稀释涂布平板（将样品涂布到_纤维素分解菌的培养基上）挑选产生 的菌落（产生纤维素酶的菌落周围出现 ）。【习题巩固】1.不同的微生物对营养物质的需要各不相同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物营养的描述中，不正确的是()。A氮源物质为该微生物提供必要

9、的氮素B碳源物质也是该微生物的能源物质C无机盐是该微生物不可缺少的营养物质D水是该微生物的营养要素之一2.如右图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1、2、3、4、5。下列操作方法正确的是( )。A操作前要将接种环放在火焰旁灭菌B划线操作须在火焰上进行C在5区域中才可以得到所需菌落D在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌3.用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是()。A涂布了一个平板，统计的菌落数是230B涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238C涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212

10、和256，取平均值163D涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值2334.可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是( )。A以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂B以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂C以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹试剂D以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂5.通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出( )。大肠杆菌霉菌放线菌固氮细菌A B C D6.培养基

11、、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法依次是 ( )化学消毒灼烧灭菌干热灭菌紫外线消毒高压蒸汽灭菌巴氏消毒法A B C D7.下列关于微生物分离和培养的有关叙述，错误的是（ ）A. 微生物培养前，需对培养基进行消毒B. 测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法C. 分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度D. 分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源8.用平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时（ ）可以用相同的培养基 都需要使用接种针进行接种都需要在火焰旁进行接种 都可以用来计数活菌A B C D9. “筛选”是分离和培养生物新类型常用的手段，下列

12、有关技术中不能筛选成功的是A在全营养的LB培养基(普通培养基)中，筛选大肠杆菌B在尿素固体培养基中，筛选能够分解尿素的微生物C用纤维素为唯一碳源的培养基，筛选能分解纤维素的微生物D在培养基中加入不同浓度的氯化钠，筛选抗盐突变体植物10.可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是( )A以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂B以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂C以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹试剂D以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂11.（2013江苏卷,18）某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是（ ）A. 培养基分装到培养皿后进行灭菌B. 转换划线角度后需灼烧接

13、种环再进行划线C. 接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养D. 培养过程中每隔一周观察一次12.（2014江苏30）为了获得ß-胡萝卜素产品,某小组开展了产ß-胡萝卜素酵母的筛选与色素提取实验。 请回答下列问题:(1)实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是 ;为了减少灭菌后器皿被污染,灭菌前应该 。(2)为了筛选出酵母菌,培养基中添加了青霉素,其目的是 。(3)右图是灭菌锅及其局部剖面示意图,图中甲、乙、丙指示的依次是 。 (填序号)安全阀、放气阀、压力表放气阀、安全阀、压力表安全阀、放气阀、温度表放气阀、安全阀、温度表(4)为了将分离到的菌株纯化,挑取了菌落在 3 块相同平板上

14、划线,结果其中一块平板的各划线区均未见菌生长,最可能的原因是 。(5)为增加ß-胡萝卜素提取量,在研磨酵母细胞时,添加石英砂的目的是 ;研磨时 (填“需要”或“不需要”)添加 CaCO3,理由是 。13.（2015江苏31）人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃,可用来发酵处理秸秆,提高秸秆的营养价值。为了增强发酵效果,研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株,并对其降解纤维素能力进行了研究。请回答下列问题: (1)在样品稀释和涂布平板步骤中,下列选项不需要的是 _ (填序号)。 酒精灯 于培养皿 显微镜 无菌水 (2)在涂布平板时,滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是 。 (3)向试管

15、内分装含琼脂的培养基时,若试管口粘附有培养基,需要用酒精棉球擦净的原因是 。 (4)刚果红可以与纤维素形成红色复合物,但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。研究人员在刚果红培养基平板上,筛到了几株有透明降解圈的菌落(见右图)。 图中降解圈大小与纤维素酶的 有关。 图中降解纤维素能力最强的菌株是 (填图中序号)。 (5)研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4,在不同温度和pH条件下进行发酵, 测得发酵液中酶活性的结果见下图,推测菌株 _ 更适合用于人工瘤胃发酵,理由是 。 14.尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数

16、量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示，实验步骤如图所示。请分析回答问题：KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO4·7H2O0.2 g葡萄糖10 g尿素1 g琼脂15 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL (1)此培养基能否用于植物组织培养？_，理由是_。(2)培养基中加入尿素的目的是筛选_，这种培养基属于_培养基。(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的_和_，实验需要振荡培养，原因是_。(4)转为固体培养时，常采用_的方法接种，获得单菌落后

17、继续筛选。(5)下列材料或用具中：培养细菌用的培养基与培养皿；玻棒、试管、锥形瓶和吸管；实验操作者的双手。需要灭菌的是：_；需要消毒的是：_(填序号)。(6)在进行分离分解尿素的细菌的实验时，A同学从培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的实验结果产生的原因可能有_(填序号)。由于土样不同由于培养基污染由于操作失误没有设置对照(7)简述土壤中可分解尿素的细菌的鉴定方法及原理：_微生物的培养与应用【基础知识】一、微生物的培养1.固体 天然 合成 选择 青霉素 食盐 鉴别 伊红美蓝2.干热 湿热（高压蒸汽） 160 170 100 121 3.平板划线法 稀释涂布

18、平板法 稀释涂布平板法上次 冷却 第一 划破 倒置二、2.尿素 选择3.稀释涂布平板法5.配置5ml溶液，取0.5ml溶液注入含4.5ml无菌水的试管中，以此类推，最后试管吸取走0.5ml.（或者1:9）一般选取菌落数为30300的一组计算值比真实值小，因为可能多个个体形成一个菌落6.红三、3.刚果红 透明圈 纤维素4.维生素 选择 鉴别 透明圈 透明圈【习题巩固】1. 【答案】B 【解析】以CO2为唯一碳源可知该微生物为自养型微生物，可以利用CO2合成有机物，该无机碳源不能为微生物提供能量，其能源来自于光能或分解有机物释放出的化学能。2. 【答案】D【解析】在每次划线前后都要对接种环进行灭菌

19、，接种环的灭菌方法是在火焰上灼烧，接种时划线操作是在火焰旁进行。在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落。3. 【答案】D【解析】在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以A、B不正确。C项虽涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，此时，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。4. 【答案】A【解析】在以尿素为唯一氮源的培养基中，不能分解尿素获得氮源的细菌不能生长，而分解尿素的细菌能利用尿素作氮源，将尿素分解为氨，使pH升高。若培养基中加入酚红指示剂，指示剂将变红。此培养基既属于选择

20、培养基，又属于鉴别培养基。5. 【答案】A【解析】缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长，而固氮细菌能生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌，霉菌能生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌，放线菌能生长。6. 【答案】A【解析】培养基用高压蒸汽灭菌；培养皿耐高温，需用干热灭菌；接种环可用灼烧灭菌达到迅速彻底的灭菌效果；实验操作者的双手可用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手；空气可用紫外线消毒；牛奶为不破坏其营养成分可采用巴氏消毒法。7. 【答案】A【解析】微生物培养前，需对培养基进行灭菌，而不是消毒；单个细菌时肉眼看不见的，肉眼可见的是群落，因此测定土壤样品中的细菌数目，常用菌

21、落计数法而一般不用活菌数计数；分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度以便能从中选择出菌落数在30-300间的平板进行计数；能分解尿素的细菌，可以利用尿素为氮源，其它微生物不能，故分离能分解尿素的细菌时，要以尿素作为培养基中唯一的氮源。8. 【答案】C【解析】平板划线法或稀释涂布平板法都使用固体培养基，故正确；平板划线法采用接种针进行操作，而稀释涂布平板法采用涂布器进行操作，故错误；纯化时，要进行无菌操作，需要在火焰旁接种，避免空气中的微生物混入培养基，故正确；平板划线法一般用于分离而不是计数，故错误。9. 【答案】A【解析】全营养的LB培养基(普通培养基)上可生长多种细菌，筛选不到纯的大肠杆菌。10. 【答案】A【解析】在以尿素为唯一氮源的培养基中，不能分解尿素获得氮源的细菌不能生长，而分解尿素