依诺的肝素的制备和纯化

1、费用：50000元以上 5000-10000元 10000-50000元1000-3000元 1000-5000 1000-5000元 500元以下 类型：新产品开发 生产工艺改进 检测方法建立/改进 设备性能考察 辅助性试验 其 它 试 验 江西浩然生物医药有限公司项目研发计划项目名称： HR-08技术研究 负 责 人： 起止时间： 项目编号： HR-08-1503002 目 录内 容页码一背景资料二立项目的三研究内容四资金预算五实验研究时间计划一、 背景资料依诺肝素钠(enoxaparin sodium，1)属于低分子肝素，主要特征为分子中有一个4一烯吡喃糖醛酸结构(图1)。本品抗血栓作用

2、强、出血危险性小，是目前抗凝血、抗血栓形成的主要治疗药物之一，肝素通过酶或化学的方法部分降解就可以获得低分子肝素。低分子肝素因为分子量较小，不易被IV因子中和，抗凝血效果和纤溶作用得以增强，而抗血小板，影响血小板功能，影响血液的凝固性，诱发出血的作用大为减弱，加之生物利用度高达98%，量效关系明确，抗凝效果易于预防，血浆半衰期较普通肝素长2-3倍，同时具有快速和持续的抗血栓形成作用，改善血流动力学。依诺肝素钠由法国AVentis 公司研发，并与1993年申请专利。但该专利未涉及生成过程中酯化率，成环率及生产纯化等关键工艺。采用该转利生成的样品无法达到欧洲药典4.0版规定的标准。本研究通过控制上

3、述反应条件，得到适合于工业生成的依诺肝素钠工艺，所得的成品溶液颜色符合欧洲药典4.0版要求，其余质量指标均符合欧洲药典5.3版。二、 实验目的建立HR制备和纯化的工艺技术参数，进行工艺放大和工艺稳定性研究。三、实验内容：实验步骤：3.1成盐：3.1.1 称取06样品（例如100g）用纯化水(1000ml)溶解到10%溶液，边加入边搅拌，至均匀；称取06样品质量2.5倍的苄索氯胺(250g)用纯化水(1250ml)溶解至20%溶液；3.1.2将上述20%苄索氯胺溶液缓缓加入肝素钠溶液中，边加边搅拌，加完后继续搅拌0.5小时；3.1.3将反应液离心收集沉淀（离心速率与时间根据离心机直径调整，一般来

4、说离心上清越清越好，离心效果直接与回收率相关，一般选用沉降式离心机？；3.1.4将沉淀捣碎（尽量捣碎）加入1.1中肝素钠质量10倍量的纯化水(1000ml)搅拌洗涤0.5小时，离心收集沉淀（离心速率与时间根据离心机直径调整，一般来说离心上清越清越好，离心效果直接与回收率相关。）；3.1.5重复1.4操作；3.1.6将沉淀60烘干，烘干至水分接近0.5%（用卤素水分测定仪110，6分钟），得到成盐物中间体。(300g左右)（回收率以起始06样品质量算，应该在300%（290%-310%）左右，烘干过程要注意翻盘，最终成颗粒（颗粒直径尽量小于1cm），烘干温度要控制好，一定不要超过 60

5、 ）3.2 成酯：3.2.1将成盐物中间体（300g）用5倍量的二氯甲烷（1500ml）溶解，边加入边搅拌，至均匀，溶解温度36；3.2.2加入成盐物（300g）1倍量的氯化苄(300ml)，边搅拌边加入，完全加入后搅拌反应25小时，反应温度35-36；3.2.3加入反应液体积2倍量(3600ml左右)的10%（m/v，即结晶乙酸钠质量与甲醇体积之比）乙酸钠甲醇溶液至反应液中，边加入边搅拌，完全加入后，将温度控制在25搅拌反应1个小时，离心收集沉淀（离心速率与时间根据离心机直径调整，一般来说离心上清越清越好，离心效果直接与回收率相关。）；3.2.4加入反应液0.5倍量（900ml左右

6、）的甲醇，边搅拌边加入，至完全加入后，搅拌洗涤沉淀1个小时，离心收集沉淀（离心速率与时间根据离心机直径调整，一般来说离心上清越清越好，离心效果直接与回收率相关。）3.2.5重复2.4；3.2.6将沉淀60真空烘干，烘干至干燥失重接近5%，得成酯物中间体。（120-150g左右）（ 烘干过程中注意翻盘，便于控制干燥失重，成酯物收率（相对于成盐物）为40-50%）3.3 降解，纯化：3.3.1将成酯物（120-150g左右，下面的计算按照135g计算）用20倍量（m/v）纯化水（2700ml，根据成酯物质量调整）溶解，边加入边搅拌，溶解温度56，完全溶解加入原料肝素钠重量0.08倍量的氢

7、氧化钠（8g）（可以先用少量纯化水溶解），边加入边搅拌，至均匀，反应温度56，完全加入后继续搅拌降解80分钟；3.3.2降解完毕，快速用6N盐酸调溶液pH值至中性（pH试纸检测即可），用澄清板过滤；3.3.3滤液加入溶液体积（2700ml）0.5%的过氧化氢（30%浓度）(13.5ml)，边加入边搅拌，完全加入后用20%氢氧化钠调溶液pH值至10（pH试纸检测即可），混匀后静置氧化24小时（过程中每两个小时调节pH值10左右），氧化温度27；3.3.4加入溶液体积（2700ml）2%的氯化钠(54g)溶解，边加入边搅拌，至均匀，然后缓慢加入4倍量甲醇（10800ml左右），边加入边搅拌，至均匀

8、，静置（一般静置时间在半小时至一小时以内），抽走上清。（如果中控可在此处，中控只需控分子量，如果不符合要求则继续4倍量甲醇）3.3.5离心收集沉淀（130g-150g,下面按照140g计算）（离心速率与时间根据离心机直径调整，一般来说离心上清越清越好，离心效果直接与回收率相关。）；（如果中控可在此处，中控只需控分子量，如果不符合要求，则继续4倍量甲醇。3. 3.6将沉淀（140g）用纯化水（700ml）溶解至20%浓度，加入溶液体积（700ml）1.0%的过氧化氢（7ml），20%氢氧化钠调溶液pH值10（pH试纸检测即可），混匀后静置氧化氧化24小时（过程中每两个小时调节pH值10左右），氧

9、化温度27；3.3.7用澄清板过滤，6N盐酸调pH中性（pH试纸检测即可）；3.3.8加入溶液体积（700ml）2%的氯化钠（14g）溶解，边加入边搅拌，至均匀，然后缓慢加入4倍量甲醇（2800ml），边加入边搅拌，至均匀，静置（一般静置时间在半小时至一小时以内），抽走上清；3.3.9离心收集沉淀（130g左右，要求沉淀中甲醇含量要低，便于冻干控制残留），（离心速率与时间根据离心机直径调整，一般来说离心上清越清越好，离心效果直接与回收率相关）。将沉淀（130g左右）用纯化水（650ml）溶解至20%浓度；3.3.10调溶液pH7.0左右（用ph计调节，此pH关系最终产品pH项检测是否合格，调节

10、要稍微准确些），用0.22微米滤膜或滤芯过滤，冻干（20kg06样品用10平米冻干机）。（ 回收率以起始06样品质量算在65%左右）4. 备注：冻干母液是20%浓度的溶液，即0.22微米滤膜或滤芯过滤后的溶液。5.6. （实验内容1 肝素苄索氯铵盐的合成：取肝素钠xg， 加水5xml溶解；取苄索氯铵2.5xg溶于水l 0x ml中，搅拌下将其缓慢加至肝素钠溶液中过滤。滤饼用水洗涤，烘干，得肝素苄索氯铵盐3.12x g。2 肝素苄基酯的合成：取肝素苄索氯铵盐3xg，加二氯甲烷15xml搅拌溶解后， 缓慢滴加氯苄3.15x ml，35"C反应25h。反应毕加溶有醋酸钠1.8x

11、g的甲醇18x ml，待沉淀析出后，过滤。滤饼用甲醇洗涤，干燥，得肝素苄基酯l.05x g。3 碱性条件下解聚：取肝素苄基酯3x g，溶于水90x ml中，加热至62 ，加入氢氧化钠0.45x g，搅拌解聚1h。反应完毕，冷却，用盐酸调至pH 60，加氯化钠90g使其终浓度为10。边搅拌边加甲醇0.27x L，析出沉淀，过滤。滤饼用甲醇洗涤，减压干燥，得黄褐色1粗品2x g.4 纯化：取1粗品2.3x g，加水溶解得5 溶液，加入活性炭，搅拌，过滤，滤液减压浓缩至浓度为25(wv)。将1浓缩液上非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂柱，用水洗脱，收集目标峰。收集液(约46x m1)中加入3倍体积乙醇沉淀1，过滤，滤饼加适量水溶解后冷冻干燥，得1成品1.88x g。总收率