染色体与DNA3复制PPT课件

1、分散模型(dispersive (dispersive model)model)亲代双链被切成双链片段，而这些片段又可作为新合成双链片段的模板，新、老双链片段又以某种方式聚集成“杂种链” 第1页/共48页半保留复制模型(semiconservative (semiconservative replication modelreplication model）DNADNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNADNA链，这样新合成的子代DNADNA分子中一条链来自亲代DNADNA，另一条链是新合成的。 第2页/共48页半保留复制的实验证据 （Me

2、selson Meselson 和 StahlStahl，19581958）第3页/共48页复制叉与复制泡从打开的起点向一个方向形成一个的叉形或Y Y形 从打开的起点向两个方向形成 复制开始时，双链打开第4页/共48页2 2、DNADNA复制的半不连续性前导链RNARNA引物岗崎片段 随从链 原核：1000-2000bp1000-2000bp真核：100-200bp 100-200bp 第5页/共48页依DNADNA合成的起始方式，复制可分为从新起始与共价延伸两种类型。前者是前导链从新开始，也叫复制叉式复制；后者是先导链共价结合在一条亲代链上，也叫滚环式复制。 （二）DNADNA复制的几种主要

3、方式第6页/共48页1 1、复制叉式复制复制叉式复制是真核生物和原核生物中普遍存在的DNADNA复制方式。滚环式复制是单向复制的特殊方式，是某些噬菌体DNADNA复制的共同方式。另外某些双链DNADNA的合成也通过滚环复制的方式进行。2 2、滚环式复制第7页/共48页（1 1）滚环复制第8页/共48页（2 2）噜噗滚环复制（looped rolling circle replicationlooped rolling circle replication）第9页/共48页（3 3）线粒体DNADNA的D-D-噜噗(displacement (displacement loop)loop)复制第

4、10页/共48页(4) (4) 型第11页/共48页DNADNA复制的全部过程可以人为地分成三个阶段第一阶段为DNADNA复制的起始阶段，这个阶段包括起始点，复制方向以及引发体的形成；第二阶段为DNADNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNARNA引物后填补空缺及连接岗崎片段；第三阶段为DNADNA复制的终止阶段。在DNADNA复制的整个过程中需要3030多种酶及蛋白质分子参加（三）DNADNA复制的过程第12页/共48页（1 1）DNADNA复制的起始点(origin of replication)(origin of replication)：复制起始的特定DNADNA序列 复制

5、起点的一般特征：1 1、它们都由多个独特的短重复序列组成；2 2、这些短重复序列被亚多基的复制起点结合蛋白所识别；它对于在复制起点组装复制酶具有关键作用；3 3、复制起点附近一般有一个富含A-TA-T的序列，以利于双螺旋DNADNA解链或解旋，并产生单链DNADNA复制模板。 复制子或复制单元（repliconreplicon）： 染色体上能够进行独立复制的单位。细菌一个复制子，真核生物一条染色体上多个复制子。1 1、DNADNA复制的起始阶段第13页/共48页 定点开始双向复制 原核生物和真核生物DNADNA复制最主要的形式 定点开始单向复制 质粒colE1colE1（2 2）DNADNA复

6、制的方向第14页/共48页 两点开始单向复制 腺病毒DNADNA的复制 第15页/共48页 解链酶(helicase) (helicase) （3 3）DNADNA复制起始、引发体的形成及所参与的酶和蛋白质 DNA DNA复制、修复、重组及接合过程，两条互补链必须部分分开形成单链DNADNA中间体-解旋-螺旋酶催化 发动蛋白，具有依赖DNADNA的ATPaseATPase活性，把ATPATP水解产生的自由能转化为解旋DNADNA并使螺旋酶本身沿DNADNA链移动的机械能 500-1000500-1000bp/bp/秒 真核生物转录复合物的组分，有些螺旋酶具有RNARNA螺旋酶活性第16页/共4

7、8页 单链结合蛋白(single strand binding proteins, (single strand binding proteins, SSBP)SSBP)又称为双螺旋去稳定蛋白（helix destabilizinghelix destabilizing protein protein）由177177个aaaa组成在E.coli E.coli 中以四聚体存在分子量为74KDa74KDa在原核中SSBSSB与DNADNA结合表现出协同效应。A. SSBA. SSB之间的相互作用；B. B. 第一个SSBSSB和DNADNA的结合改变了DNADNA的结构。 引发体的形成A. A.

8、引物酶(primase)(primase)B. B. 引发体(primosome)(primosome)第17页/共48页（1 1）DNADNA的聚合反应和DNADNA聚合酶2 2、DNADNA复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子DNADNA聚合酶的共同特点第一，需要提供合成模板；第二，不能起始新的DNADNA链，必须要有引物提供33OHOH；第三，合成的方向都是55 33第四，除聚合DNADNA外还有其它功能第18页/共48页 DNADNA聚合酶I IDNA polDNA pol是由一条多肽链组成，分子量为109KD109KD。酶分子中含有一个Zn+Zn+，是聚合活性必须的。 DNADNA

9、聚合酶有6 6个结合位点： 模板结合位点； 引物结合位点； 引物33OHOH结合位点； 底物dNTPdNTP结合位点； 5353外切酶结合位点； 3535校正位点。第19页/共48页DNADNA聚合酶的功能A. 53A. 53聚合活性 图 DNA聚合酶催化的DNA链延长第20页/共48页B. 35B. 35外切活性第21页/共48页C. 53C. 53外切活性 切口平移（nick translationnick translation）； 链的置换； 模板转换（template-switchingtemplate-switching）缺刻平移标记DNA探针第22页/共48页D. D. 内切酶活

10、性第23页/共48页大肠杆菌DNADNA聚合酶的KlenowKlenow片段（E.coliDNA Pol E.coliDNA Pol Klenow fragmentKlenow fragment），又叫做KlenowKlenow聚合酶或KlenowKlenow大片段酶。它是由大肠杆菌DNADNA聚合酶全酶，经枯草杆菌蛋白酶（一种蛋白质分解酶）处理之后，产生出来的分子量为76KD76KD的大片段分子。KlenowKlenow聚合酶仍具有5 35 3的聚合活性和3 53 5核酸外切酶活性，但失去了全酶的5 35 3的核酸外切酶活性。在DNADNA分子克隆中，KlenowKlenow聚合酶的主要用途

11、有：（i i）修补经限制酶消化的DNADNA所形成的33隐蔽末端；（iiii）标记DNADNA片段的末端；（iiiiii）cDNAcDNA克隆中的第二链cDNAcDNA的合成；（iviv）DNADNA序列测定。KlenowKlenow片段第24页/共48页 分子量120KD120KD 100 100个酶分子/ /细胞 活性是DNA pol IDNA pol I的5%5% 具有5353聚合活性和3535外切活性 没有5353外切活性 与DNADNA修复有关 DNADNA聚合酶IIII第25页/共48页 DNADNA复制过程中起主要作用的酶 由一个多亚基组成的蛋白分子 DNADNA聚合酶IIIII

12、I第26页/共48页大肠杆菌DNADNA聚合酶特征DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶分子量分子量109KD120KD600KD每个细胞中的分子数每个细胞中的分子数40017-10010-2053聚合活性聚合活性+37转化率核苷酸数酶分转化率核苷酸数酶分子子分钟分钟6003030,00053外切活性外切活性+-35外切活性外切活性+切刻平移活性切刻平移活性+-对对dNTP亲和力亲和力低低低低高高功能功能修复修复不详不详复制复制去除引物去除引物 填补空缺填补空缺 第27页/共48页拓扑异构酶(topoisomerase)(topoisomerase)上一堂课已经介绍过。(2)(

13、2)与超螺旋松驰有关的酶表 大肠杆菌和真核生物中的拓扑异构酶类型类型作用作用对超螺旋的作用对超螺旋的作用型拓扑异构酶型拓扑异构酶大肠杆菌大肠杆菌切开一股切开一股DNADNA链链松驰负超螺旋松驰负超螺旋真核生物真核生物切开一股切开一股DNADNA链链松驰正，负超螺旋松驰正，负超螺旋型拓扑异构酶型拓扑异构酶大肠杆菌大肠杆菌切开二股切开二股DNADNA链链构驰正超螺旋；构驰正超螺旋；依赖依赖ATPATP引入负超螺旋，引入负超螺旋，解环连等解环连等真核生物真核生物切开二股切开二股DNADNA链链松驰正超旋，松驰正超旋，依赖依赖ATPATP但不能引入负超螺旋但不能引入负超螺旋第28页/共48页3 3、D

14、NADNA复制的终止阶段连接酶(ligase) (ligase) 连接酶的催化反应复制终点（terminusterminus）：决定复制终止的DNADNA片段。其作用机制是分三步进行： E EATPEATPEAMPAMPppippi 在E.coliE.coli中，E ENADENADEAMPAMPNMNNMN（烟酰胺单核苷酸） E-AMPE-AMP上的AMPAMP转移到DNADNA的5-PO45-PO4上使其活化 活化的55PO4PO4与相邻的33OHOH作用形成3355磷酸二酯键，并释放出AMPAMP。第29页/共48页E.coliE.coli的复制终止 现已发现有两个终止区域（terE,D

15、,AterE,D,A和ter C,Bter C,B），位于相遇点的另一侧100Kb100Kb处。每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的。 terter顺序有一个23bp23bp的区域，在体外可导致复制的终止，但其功能显示了一定的方向性。 终止需要tustus(terminus (terminus utilization substance)utilization substance)基因的产物Tus(36kD)Tus(36kD)， TusTus能识别terter保守顺序，并阻止复制叉继续前进。 terter-Tus-Tus复合物可能通过抑制螺旋酶来实行终止第30页/共48页1 1、与原

16、核生物不同，真核生物DNADNA复制有许多起始点。2 2、真核生物DNADNA复制的速度(60(60核苷酸/ /每秒钟) )比原核生物DNADNA复制的速度(E.coli 1700(E.coli 1700核苷酸/ /每秒钟) )慢3 3、真核生物的染色体在全部完成复制之前，各个起始点上的DNADNA的复制不能再开始，而在快速生长的原核生物中，复制起始点可以连续开始新的DNADNA复制，表现为虽只有一个复制单元，但可有多个复制叉。（四）真核生物DNADNA复制的特点第31页/共48页4 4、真核生物DNADNA的复制子被称为ARSARS（autonomously autonomously rep

17、licating sequencesreplicating sequences），长约150bp150bp，包括数个复制起始必需的保守区。真核生物DNADNA复制的起始需要起始原点识别复合物（ORCORC）参与。 5 5、在真核生物中主要有5 5种DNADNA聚合酶，分别为DNADNA聚合酶、和，其特性如下表。真核生物的DNADNA聚合酶一般都不具有核酸外切酶活性, ,推测一定有另外的酶在DNADNA复制中起校对作用。第32页/共48页性质性质DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶亚基数亚基数4 41 12 22

18、-32-311在细胞内分布在细胞内分布核内核内核内核内线粒体线粒体核内核内核内核内功能功能DNADNA引物合引物合成成损伤修复损伤修复线粒体线粒体DNADNA复制复制主要主要DNADNA复复制酶制酶修复修复3535外切外切无无无无有有有有有有5353外切外切无无无无无无无无无无5353聚合聚合有有有有有有有有有有持续合成能力持续合成能力中等中等低低高高有有PCNAPCNA时时高高高高DNADNA合成抑制剂合成抑制剂蚜肠霉素蚜肠霉素ddTTPddTTPddTTPddTTP蚜肠霉素蚜肠霉素蚜肠霉素蚜肠霉素真核生物DNADNA聚合酶第33页/共48页6 6、端粒复制端粒复制的生物学意义：（1 1）维

19、持染色体的完成性，决定细胞的寿命；（2 2）维持染色体的独立性，若无端粒，两个染色体末端很可能融合到一起；（3 3）解决末端复制问题，端粒酶能与端粒作用，延伸其长度。端粒酶催化端区TGTG链的合成第34页/共48页（五）DNADNA复制的忠实性和调控1 1、DNADNA复制的忠实性（fidelityfidelity） ( (二)DNA)DNA聚合酶的自我校正( (三)DNA)DNA聚合酶催化的反应机制( (四) )错配校正系统( (一)RNA)RNA引物为什么在DNADNA复制起始要使用需要清除的RNARNA作为引物，而不使用可以不必清除的DNADNA为引物呢？ 第35页/共48页问题: :

20、为什么在DNADNA复制起始要使用需要清除的RNARNA作为引物，而不使用可以不必清除的DNADNA为引物呢？在DNADNA复制中，开始从头合成的引物（RNARNA或DNADNA）拷贝碱基容易错配，误差率至少为1010-4-4；而且，开始阶段所形成的短核苷酸序列中的错配碱基也不易被校正。如果冈崎片段中的这些引物拷贝作为终产物保留下来，即使它们所占的比例只有5%5%，也会造成基因突变大大增加。因此，DNADNA复制中从头合成的引物最终必须除去，而用RNARNA引物要比DNADNA引物有利得多，因为RNARNA引物的核苷酸序列即使有错配最终也被清除，并由DNADNA聚合酶I I合成的正确短DNAD

21、NA片段来填补。第36页/共48页（五）DNADNA复制的忠实性和调控1 1、DNADNA复制的忠实性（fidelityfidelity） ( (一)RNA)RNA引物为什么在DNADNA复制起始要使用需要清除的RNARNA作为引物，而不使用可以不必清除的DNADNA为引物呢？ ( (二)DNA)DNA聚合酶的自我校正( (三)DNA)DNA聚合酶催化的反应机制( (四) )错配校正系统第37页/共48页第38页/共48页第39页/共48页2 2、DNADNA复制的调控复制的调控发生在起始阶段，从复制原点起始一轮DNADNA复制，特异性蛋白因子对原点的识别和结合是关键的一步。当DNADNA复制

22、起始以后，这种可为复制机构所利用的状态发生了改变，或者是DNADNA被修饰酶（如甲基化和去甲基化等），或者是特异性蛋白质因子被修饰（磷酸化和去磷酸化等）。这样，使得在一个细胞周期中，复制原点通常只能被使用一次。总之，DNADNA复制是由活化物、阻遏物及它们的相互作用调节的。DNADNA复制的调控，包括DNADNA水平、RNARNA水平以及蛋白水平。第40页/共48页（1 1）大肠杆菌染色体DNADNA的复制调控 细胞内dnaAdnaA蛋白在起始时起关键作用，它的浓度决定了oriCoriC质粒复制起始频率。 半甲基化：oriCoriC亲代链保持甲基化，新合成的链则未被甲基化 oriCoriC和dnaAdnaA位点再甲基化的延迟 第41页/共48页（2 2）ColE1ColE1质粒DNADNA的复制调控第42页/共48页（3 3）单链DNADNA噬菌体的复制调控角噬菌体（X174X174、G4G4、S13S13）丝状噬菌体（M13M13、f