益气活血药对心肌组织及H9C2细胞Cx43表达和凋亡的影响

1、益气活血药对心肌组织及益气活血药对心肌组织及h9c2细胞细胞cx43表达和凋亡的影响表达和凋亡的影响 吴爱明，娄利霞，高永红，吴爱明，娄利霞，高永红，张冬梅，朱海燕，王硕仁张冬梅，朱海燕，王硕仁北京中医药大学东直门医院北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部和北京市重点实验室中医内科学教育部和北京市重点实验室2主要内容主要内容研究背景研究背景1材料与方法材料与方法2结结 果果3讨讨 论论43研究背景研究背景心肌缝隙连接蛋白心肌缝隙连接蛋白4343心肌细胞凋亡心肌细胞凋亡n心血管系统疾病是危害人类心血管系统疾病是危害人类健康的常见病。心肌缝隙连健康的常见病。心肌缝隙连接蛋白接蛋白4343和细胞凋

2、亡的异常和细胞凋亡的异常在心血管疾病的发病过程中在心血管疾病的发病过程中都扮演了重要角色。都扮演了重要角色。 4心肌缝隙连接蛋白心肌缝隙连接蛋白43(cx43)n缝隙连接缝隙连接是一种特殊膜结构，由两个连接子对接而成，是一种特殊膜结构，由两个连接子对接而成，每个连接子包含来自毗邻细胞的六个连接蛋白，直接每个连接子包含来自毗邻细胞的六个连接蛋白，直接连接两个细胞的胞质，允许相邻细胞间电信号和化学连接两个细胞的胞质，允许相邻细胞间电信号和化学信号的直接通讯。连接蛋白家族有信号的直接通讯。连接蛋白家族有20多个成员，就心多个成员，就心室而言，表达最丰富的是室而言，表达最丰富的是cx43。5n心肌缺血

3、时，心肌缺血时，cx43分分布和表达异常会导致心布和表达异常会导致心肌细胞电偶联的缺失，肌细胞电偶联的缺失，易于发生室性心律失常易于发生室性心律失常甚至猝死甚至猝死 。n并且并且cx43的异常还会的异常还会导致心肌细胞间的代谢导致心肌细胞间的代谢障碍。障碍。 6心肌细胞凋亡心肌细胞凋亡n细胞凋亡又称程序性细胞死亡，细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是一种生理现象，但病理状态是一种生理现象，但病理状态下细胞凋亡的增加与心肌缺血、下细胞凋亡的增加与心肌缺血、缺血再灌注损伤和心力衰竭的缺血再灌注损伤和心力衰竭的发生都密切相关。发生都密切相关。 n过度的细胞凋亡会加速过度的细胞凋亡会加速心肌细胞的丢失，造成

4、心肌细胞的丢失，造成心功能的恶化，并促进心功能的恶化，并促进心室重构的发生和发展。心室重构的发生和发展。 7材料与方法材料与方法8实验材料实验材料n实验动物实验动物n雄性雄性sd大鼠，体重大鼠，体重200240g，许可号：，许可号：scxk（京）（京）2006-0009。 n实验细胞实验细胞nrat h9c2心肌细胞系（心肌细胞系（atcc number：crl-1446） n实验用药实验用药n生脉注射液（红参、麦冬、五味子），生脉注射液（红参、麦冬、五味子），10ml/支，雅安三九药业有限公支，雅安三九药业有限公司（批号：司（批号：100301）n血塞通注射液（三七总皂苷），血塞通注射液（三

5、七总皂苷），250mg/10ml/支，昆明制药集团股份支，昆明制药集团股份有限公司（批号：有限公司（批号：10dl04）。）。 n主要试剂主要试剂n兔抗兔抗cx43多克隆抗体（批号：多克隆抗体（批号：10440704）nhoechst凋亡细胞核和凋亡小体染色试剂盒凋亡细胞核和凋亡小体染色试剂盒 （#c1100）9实验方法实验方法10整体实验分组与给药方法整体实验分组与给药方法n大鼠随机分为：大鼠随机分为：n益气活血组：生脉注射液联合血塞通注射液益气活血组：生脉注射液联合血塞通注射液n卡托普利组：卡托普利卡托普利组：卡托普利n模型组：生理盐水模型组：生理盐水n假手术组：生理盐水假手术组：生理盐水

6、n连续给药一个月连续给药一个月 11心肌梗死大鼠模型制备心肌梗死大鼠模型制备 参照文献，采用参照文献，采用冠脉结扎法制作冠脉结扎法制作大鼠心肌梗死模大鼠心肌梗死模型。型。王硕仁王硕仁, ,王振涛王振涛, ,赵明镜赵明镜, ,李敏李敏. .心气虚病证动物模型心气虚病证动物模型及其评价体系的构建及其评价体系的构建. .中国中国实验动物学报实验动物学报.2002;10(1): .2002;10(1): 33-38.33-38. 12心梗模型大鼠心电图和心脏超声评价心梗模型大鼠心电图和心脏超声评价结扎冠脉前结扎冠脉前 结扎冠脉后结扎冠脉后模型组模型组 心功能比较心功能比较n采用心电图和心脏采用心电图和

7、心脏超声评价心梗大鼠超声评价心梗大鼠造模是否成功。造模是否成功。n术后与术前比较，术后与术前比较，大鼠心电图大鼠心电图st段明段明显抬高。显抬高。n取材前超声检查显取材前超声检查显示模型大鼠左心室示模型大鼠左心室内径明显扩大，室内径明显扩大，室壁变薄，收缩运动壁变薄，收缩运动减弱，心功能降低。减弱，心功能降低。13在体电刺激诱发室颤实验方法在体电刺激诱发室颤实验方法n参照文献，大鼠麻醉后固定，呼吸机辅助呼吸，开胸参照文献，大鼠麻醉后固定，呼吸机辅助呼吸，开胸暴露心脏，连接刺激电极。暴露心脏，连接刺激电极。n采用程控电刺激诱发室颤，记录室颤阈值。采用程控电刺激诱发室颤，记录室颤阈值。n柴松波柴松

8、波,王硕仁王硕仁,姚立芳姚立芳,等等.参松养心胶囊对大鼠心梗后心肌重构和和室颤阈值影响的参松养心胶囊对大鼠心梗后心肌重构和和室颤阈值影响的研究研究.中国中药杂志中国中药杂志.2009,34(16):2101-210414细胞实验分组与给药方法细胞实验分组与给药方法n正常对照组正常对照组n模型组模型组n血塞通低剂量组血塞通低剂量组n血塞通高剂量组血塞通高剂量组n细胞实验以大鼠细胞实验以大鼠h9c2心肌细胞系为研究对象，分为两个实验。心肌细胞系为研究对象，分为两个实验。n实验实验1 1：生脉联合血塞通注射液对：生脉联合血塞通注射液对h9c2h9c2细胞细胞cx43cx43损伤的影响损伤的影响n实验

9、实验2 2：生脉联合血塞通注射液对：生脉联合血塞通注射液对h9c2h9c2细胞凋亡的影响细胞凋亡的影响n两个实验均分为以下八组两个实验均分为以下八组n生脉低剂量组生脉低剂量组n生脉高剂量组生脉高剂量组n生脉和血塞通低剂量组生脉和血塞通低剂量组n生脉和血塞通高剂量组生脉和血塞通高剂量组15细胞实验细胞实验1 1：诱导：诱导h9c2h9c2细胞细胞cx43cx43损伤的方法损伤的方法n参照文献，采用参照文献，采用tpa造成造成cx43的损伤的损伤 。ntpa是一种蛋白激酶是一种蛋白激酶c的激活剂，可以增加的激活剂，可以增加cx43的磷酸化，从而降低的磷酸化，从而降低cx43通道的通透性，还能通道的

10、通透性，还能显著地降低缝隙连接的组装，并使显著地降低缝隙连接的组装，并使cx43失去稳失去稳定性。定性。nlampe pd, tenbroek em, burt jm, et al. phosphorylation of connexin43 on serine368 by protein kinase c regulates gap junctional communicationj. j cell biol, 2000, 149(7): 1503-1512.nlampe pd,lau af. the effects of connexin phosphorylation on gap ju

11、nctional communicationj. int j biochem cell biol, 2004, 36(7): 1171-1186. 16细胞实验细胞实验1 1：h9c2h9c2细胞细胞cx43cx43检测方法检测方法 n采用免疫细胞化学法检测采用免疫细胞化学法检测cx43cx43的表达的表达n主要步骤：用主要步骤：用4%4%多聚甲醛固定细胞多聚甲醛固定细胞15min15min，血清，血清封闭，滴加封闭，滴加1:1001:100稀释一抗稀释一抗44孵育过夜。次日加孵育过夜。次日加二抗，二抗，3737孵育孵育30min30min，dabdab显色，倒置显微镜拍显色，倒置显微镜拍照观

12、察。照观察。 17细胞实验细胞实验2 2：诱导：诱导h9c2h9c2细胞凋亡的方法细胞凋亡的方法n参照文献，参照文献，使用使用angang诱导心肌细胞凋亡诱导心肌细胞凋亡 。 n血管紧张素血管紧张素（angang）是一种生物活性物质，可使是一种生物活性物质，可使血管收缩，血压升高，并能够诱导心肌细胞的凋亡。血管收缩，血压升高，并能够诱导心肌细胞的凋亡。n裴兆辉裴兆辉, ,马虹马虹, ,朱妙章等朱妙章等. .血管紧张素血管紧张素诱导心肌细胞凋亡机制诱导心肌细胞凋亡机制的研究进展的研究进展j.j.心脏杂志心脏杂志,2005,17(5):482-483.,2005,17(5):482-483.18细

13、胞实验细胞实验2 2：h9c2h9c2细胞凋亡检测方法细胞凋亡检测方法 n采用采用hoechsthoechst染色法检测细胞凋亡染色法检测细胞凋亡n主要步骤：用主要步骤：用4%4%多聚甲醛固定细胞，多聚甲醛固定细胞，pbspbs洗涤洗涤1 1次，次，加入加入hoechsthoechst染色液，室温孵育染色液，室温孵育10min10min，吸弃染液，吸弃染液，pbspbs洗涤洗涤1 1次，倒置荧光显微镜观察拍照，分析凋亡次，倒置荧光显微镜观察拍照，分析凋亡细胞占总细胞数的百分比。细胞占总细胞数的百分比。 19统计学方法统计学方法n采用采用spss13.0spss13.0软件进行统计处理，实验数据

14、以软件进行统计处理，实验数据以均数均数标准差标准差( (x x) )表示。先进行正态性和表示。先进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布且方差齐的数据方差齐性检验，符合正态分布且方差齐的数据采用单因素方差分析，不符合正态分布的采用采用单因素方差分析，不符合正态分布的采用非参数检验，非参数检验，p p0.050.05为差异有统计学意义。为差异有统计学意义。 sx 20结结 果果21前期工作前期工作n课题组前期对心肌梗死大鼠模型进行了中医证课题组前期对心肌梗死大鼠模型进行了中医证候和西医病理方面的中西医结合研究。候和西医病理方面的中西医结合研究。n其中基因表达谱芯片的工作提示：心肌缝隙连其中基因表达

15、谱芯片的工作提示：心肌缝隙连接和细胞凋亡是心梗大鼠基因差异表达的聚集接和细胞凋亡是心梗大鼠基因差异表达的聚集点之一。点之一。n据此线索，本研究重点观察益气活血药对心肌据此线索，本研究重点观察益气活血药对心肌缝隙连接和凋亡的影响。缝隙连接和凋亡的影响。22心肌梗死大鼠差异基因的生物信息学分析心肌梗死大鼠差异基因的生物信息学分析23心肌梗死大鼠心肌心肌梗死大鼠心肌cx43 mrna和蛋白表达的变化和蛋白表达的变化 在芯片实验基础上，对心梗大鼠在芯片实验基础上，对心梗大鼠cx43cx43的基因和蛋白表达进行的基因和蛋白表达进行了验证，结果同样证实心肌梗死发生后了验证，结果同样证实心肌梗死发生后cx4

16、3 mrnacx43 mrna和蛋白的表达和蛋白的表达均明显降低。均明显降低。24心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡率变化心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡率变化不同时间点两组心肌细胞凋亡百分率(%)的变化0510152025303天5天10天4周8周12周时间心 肌细 胞凋 亡百 分率 （% ）手术组边缘区假手术组边缘区 *与同一时间点假手术组比较* p 0 . 0 1 ；与其它时间模型组边缘区比较p 0 . 0 1 ；与3 、 5 、10 天、 12 周模型组 边 缘区比较p 0 . 0 1 ；与3 天 、5 天、12 周模型组 边 缘区比较p 0 . 0 1 在凋亡方面，我们动态观察了从在凋亡方面，我们动态

17、观察了从冠脉结扎术后冠脉结扎术后3 3天到天到1212周，心肌细胞凋周，心肌细胞凋亡率的亡率的变化变化，模型组在各个时点凋亡率均明显高于假手术组。并且从，模型组在各个时点凋亡率均明显高于假手术组。并且从3 3天到天到4 4周，模型组凋亡率先呈下降趋势，而后从周，模型组凋亡率先呈下降趋势，而后从4 4周到周到1212周凋亡率又逐渐增加。周凋亡率又逐渐增加。25整体动物实验结果整体动物实验结果n基于以上前期工作，本研究首先进行动物实验，从组基于以上前期工作，本研究首先进行动物实验，从组织水平观察益气活血药的心脏保护作用。织水平观察益气活血药的心脏保护作用。n动物实验分为以下动物实验分为以下4部分：

18、部分：1.在体电刺激诱发室颤实验在体电刺激诱发室颤实验2.心脏形态结构改变心脏形态结构改变3.心肌心肌cx43基因表达检测基因表达检测4.心肌心肌cx43免疫组化实验免疫组化实验26动物实验动物实验1：益气活血药对在体电刺激诱发室颤：益气活血药对在体电刺激诱发室颤的阈值影响的阈值影响室颤阈值的降低，表明室颤阈值的降低，表明心脏电稳定性差，容易心脏电稳定性差，容易发生室颤。与假手术组发生室颤。与假手术组比较，心梗模型组室颤比较，心梗模型组室颤阈值降低，益气活血药阈值降低，益气活血药治疗后室颤阈值提高。治疗后室颤阈值提高。27动物实验动物实验2：心脏大体形态结构比较：心脏大体形态结构比较 假手术组

19、假手术组模型组模型组益气活血组益气活血组卡托普利组卡托普利组 取材时可见，模型组大鼠梗死范围较大，室壁变薄和心腔扩大明显。取材时可见，模型组大鼠梗死范围较大，室壁变薄和心腔扩大明显。益气活血药治疗后，梗死范围有一定程度的缩小。益气活血药治疗后，梗死范围有一定程度的缩小。28益气活血药对心梗大鼠脏体比值（全心重益气活血药对心梗大鼠脏体比值（全心重/体重）体重）的影响的影响 心肌梗死大鼠的心重心肌梗死大鼠的心重/ /体重比明显增加，益气活血药治疗体重比明显增加，益气活血药治疗后，脏体比值下降。后，脏体比值下降。29益气活血药对心梗大鼠左心室内径的影响益气活血药对心梗大鼠左心室内径的影响 模型组左心

20、室内径明显高于假手术组，益气活血药治疗模型组左心室内径明显高于假手术组，益气活血药治疗后，左室内径变小。后，左室内径变小。30益气活血药对心梗大鼠心肌梗死百分比的影响益气活血药对心梗大鼠心肌梗死百分比的影响益气活血药治疗后，心肌梗死范围明显缩小。益气活血药治疗后，心肌梗死范围明显缩小。31动物实验动物实验3：益气活血药对心梗大鼠心肌：益气活血药对心梗大鼠心肌cx43 mrna表表达的影响达的影响 心肌梗死大鼠心肌梗死大鼠cx43 mrnacx43 mrna表达明显降低，益气活血药治疗后表达明显降低，益气活血药治疗后cx43 mrnacx43 mrna表达增加。表达增加。32动物实验动物实验4：

21、心肌：心肌cx43免疫组化染色免疫组化染色 免疫组化染色心肌免疫组化染色心肌cx43cx43呈棕黄色颗粒表达，假手术组界线清晰成线状排呈棕黄色颗粒表达，假手术组界线清晰成线状排列，主要位于闰盘内，分布整齐。模型组列，主要位于闰盘内，分布整齐。模型组cx43cx43表达明显减弱甚至消失，残存表达明显减弱甚至消失，残存的的cx43cx43界线不清，分布紊乱。与模型组比较，益气活血组和卡托普利组界线不清，分布紊乱。与模型组比较，益气活血组和卡托普利组cx43cx43表达增加，分布比较整齐。表达增加，分布比较整齐。 33益气活血药对心梗大鼠心肌益气活血药对心梗大鼠心肌cx43蛋白表达的影响蛋白表达的影

22、响图像分析显示，模型组图像分析显示，模型组cx43cx43表达的表达的强度和阳性面积均低于假手术组；强度和阳性面积均低于假手术组；益气活血药治疗后，益气活血药治疗后，cx43cx43的表达和的表达和面积均显著增加。面积均显著增加。34细胞实验细胞实验n在动物实验基础上，本研究进一步开展细胞实验，拟在动物实验基础上，本研究进一步开展细胞实验，拟从心肌从心肌cx43和细胞凋亡角度，探讨益气活血药的药和细胞凋亡角度，探讨益气活血药的药效机制。效机制。n细胞实验分为以下两部分：细胞实验分为以下两部分：1.生脉注射液联合血塞通注射液对生脉注射液联合血塞通注射液对h9c2细胞细胞cx43损伤的影响损伤的影

23、响 2.生脉注射液联合血塞通注射液对生脉注射液联合血塞通注射液对h9c2细胞凋亡的影响细胞凋亡的影响 35细胞实验细胞实验n细胞实验以大鼠细胞实验以大鼠h9c2心肌细胞系为研究对象，心肌细胞系为研究对象，h9c2来源于胚胎期心脏，具有心肌细胞的特性，可以模拟来源于胚胎期心脏，具有心肌细胞的特性，可以模拟心肌细胞，常用于与心肌细胞相关的机制研究。心肌细胞，常用于与心肌细胞相关的机制研究。 h9c2 h9c2细胞细胞hehe染色染色 200200 h9c2 h9c2细胞细胞hehe染色染色 40040036细胞实验细胞实验1：生脉联合血塞通注射液对：生脉联合血塞通注射液对h9c2细胞细胞cx43损

24、伤的影响损伤的影响n细胞免疫化学染色显示，细胞免疫化学染色显示，cx43呈棕黄色表达，呈棕黄色表达， tpa刺激刺激h9c2细胞后，细胞后，cx43的表达明显降低。单独使用血塞通注射液或生脉注射液干预都可以增加的表达明显降低。单独使用血塞通注射液或生脉注射液干预都可以增加cx43的的表达，而二者联合使用效果更佳并且高剂量趋势更明显。表达，而二者联合使用效果更佳并且高剂量趋势更明显。 37细胞实验细胞实验2：生脉联合血塞通注射液对：生脉联合血塞通注射液对h9c2细胞凋亡的细胞凋亡的影响影响hoechsthoechst染色是一种经典而快染色是一种经典而快速的细胞凋亡检测方法。正常速的细胞凋亡检测方

25、法。正常细胞染色后细胞核呈蓝色；细细胞染色后细胞核呈蓝色；细胞发生凋亡时，染色质固缩，胞发生凋亡时，染色质固缩，细胞核会呈致密浓染，或呈碎细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色高亮。块状致密浓染，颜色高亮。38n结果显示：结果显示：ang处理后处理后h9c2细胞凋亡率显著增加，血塞通注射细胞凋亡率显著增加，血塞通注射液和生脉注射液都具有降低凋亡率的作用，其中生脉注射液和血塞液和生脉注射液都具有降低凋亡率的作用，其中生脉注射液和血塞通注射液联合使用时抑制凋亡的效果最明显。通注射液联合使用时抑制凋亡的效果最明显。 细胞实验细胞实验2：生脉联合血塞通注射液对：生脉联合血塞通注射液对h9c2细胞凋亡的细胞凋亡的影响影响39讨讨 论论40讨论讨论ncx43异常是引起心脏电重构而诱发心律失常重要因素之一；异常是引起心脏电重构而诱发心律失常重要因素之一；n而凋亡的过度增加会加速心肌细胞丢失，心功能恶化，促进心室重构而凋亡的过度增加会加速心肌细胞丢失，心功能恶化，促进心室重构的发生发展。的发生发展。ncx43与凋亡的关系比较复杂：与凋亡的关系比较复杂