第十七章转基因育种技术

1、 第十七章第十七章 转基因育种技术转基因育种技术第一节第一节 转基因育种的概念转基因育种的概念 一、植物遗传转化（植物基因工程）一、植物遗传转化（植物基因工程） 以植物为对象，采用以植物为对象，采用重组重组DNA技术技术，将将外源目的基因外源目的基因导入受体植物基因组，最导入受体植物基因组，最后获得外源目的基因后获得外源目的基因正确表达和稳定遗传正确表达和稳定遗传的新植物类型。的新植物类型。 核心技术是重组核心技术是重组DNA技术技术 重组重组DNA（recombinant DNA）：是指人工创造的自然界中：是指人工创造的自然界中不存在的不存在的DNA分子。主要指利用不同生物来源的分子。主要指

2、利用不同生物来源的DNA分子拼分子拼接的杂种接的杂种DNA分子。分子。 其过程包括如下几个步骤：其过程包括如下几个步骤： 从细胞或组织获得从细胞或组织获得DNA并纯化并纯化 用限制酶切割用限制酶切割DNA 将获得的限制片段连接到载体上，将获得的限制片段连接到载体上，外源外源DNA片段与载体连接后形成的片段与载体连接后形成的杂种杂种DNA分子称为重组分子称为重组DNA分子分子 重组重组DNA导入宿主细胞，在宿主细导入宿主细胞，在宿主细胞内重组胞内重组DNA分子复制，产生大量分子复制，产生大量相同拷贝的重组相同拷贝的重组DNA分子，称为克分子，称为克隆隆 克隆的克隆的DNA分子可以从宿主细胞中分子

3、可以从宿主细胞中回收，纯化回收，纯化 克隆的克隆的DNA可以转录和翻译，其产可以转录和翻译，其产品可以被分离出来用于研究或商业品可以被分离出来用于研究或商业开发开发二、转基因育种二、转基因育种 将植物遗传转化和常规育种技术相结合，将植物遗传转化和常规育种技术相结合，培育具有特定目标性状的植物新品种。培育具有特定目标性状的植物新品种。 转基因育种技术的一般实验流程转基因育种技术的一般实验流程目的基因的克隆与鉴定目的基因的克隆与鉴定转化载体的构建转化载体的构建E.ColiE.Coli转化，质粒转化，质粒抽提与鉴定抽提与鉴定农杆菌的转化与活化农杆菌的转化与活化外植体制备外植体制备浸浸 染染选择培养选

4、择培养共培养共培养移栽移栽继代繁殖继代繁殖分子检测分子检测生理检测生理检测纯化纯化转基因技术与传统技术的关系转基因技术与传统技术的关系 二者本质都是通过获得优良基因进行遗传改良。二者本质都是通过获得优良基因进行遗传改良。 在基因转移的范围和效率上有两点重要区别：在基因转移的范围和效率上有两点重要区别：第一，第一，传统技术一般传统技术一般只能在生物种内个只能在生物种内个体间实现基因转移体间实现基因转移，而转基因技术所，而转基因技术所转移的基因则不受转移的基因则不受生物体间亲缘关系生物体间亲缘关系的限制。的限制。 第二第二，传统技术传统技术是在生是在生物个体水平上进行，物个体水平上进行，操作对象是

5、整个基因操作对象是整个基因组，所转移的是大量组，所转移的是大量的基因，不可能准确的基因，不可能准确地对某个基因进行操地对某个基因进行操作和选择，对后代的作和选择，对后代的表现预见性较差。表现预见性较差。 转基因技术转基因技术转移的是转移的是经过明确定义的基因经过明确定义的基因，功能清楚，后代表，功能清楚，后代表现可准确预期，因此现可准确预期，因此，转基因技术是对传，转基因技术是对传统技术的发展和补充统技术的发展和补充。将两者紧密结合，可相得益彰，提高作物品种将两者紧密结合，可相得益彰，提高作物品种遗传改良的效率。遗传改良的效率。 第二节 目的基因的获得 根据获得基因的途径主要可以分为两大类：

6、根据基因表达的产物蛋白进行基因克隆； 从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。 根据基因表达的产物根据基因表达的产物蛋白进行基因克隆蛋白进行基因克隆 主要步骤如下：主要步骤如下：利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。局限性：兼并密码子局限性：兼并密码子 效率低效率低 未知基因及产物未知基因及产物分离蛋白质明确氨基酸序列推导核苷酸序列人工合成第三节第三节 植物遗传转化的受体系统植物遗传转化的受体系统受体受体:是指用于接受外源是指用于接受外源DNA的转化材料。

7、的转化材料。受体系统受体系统:是指用于基因转化的外植体通过细胞或其是指用于基因转化的外植体通过细胞或其 他组织培养途径，能高效、稳定地再生无性他组织培养途径，能高效、稳定地再生无性 系，并能接受外源系，并能接受外源DNA整合、转化选择对抗整合、转化选择对抗 生素敏感的再生系统。生素敏感的再生系统。转化的主要目的转化的主要目的:外源外源DNA稳定地插入植物细胞的染稳定地插入植物细胞的染 色体组中，并再生出完整的植株。色体组中，并再生出完整的植株。 11良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件：良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件：1 1、必须具有脱分化和再生能力，能够形成新的植物体。高、必须

8、具有脱分化和再生能力，能够形成新的植物体。高 效稳定的再生能力；效稳定的再生能力；2 2、受体材料要有较高的遗传稳定性；、受体材料要有较高的遗传稳定性；3 3、外植体来源方便，如胚和其它器官等；、外植体来源方便，如胚和其它器官等；4 4、对筛选剂敏感；、对筛选剂敏感；5 5、能够接受外源基因，并通过基因重组或其它途径使外源、能够接受外源基因，并通过基因重组或其它途径使外源 基因稳定地插入植物染色体组基因稳定地插入植物染色体组, ,转化率高转化率高12常用的受体材料有以下几大类型常用的受体材料有以下几大类型:1.愈伤组织再生系统愈伤组织再生系统外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（带有

9、目外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（带有目的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。优点：优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因，外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。转化效率高。缺点：缺点：遗传稳定性差、嵌合体，因此需要连续的再生系统遗传稳定性差、嵌合体，因此需要连续的再生系统132.直接分化再生系统直接分化再生系统 外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。接分化出不定芽形成再生植株。 现已建立了一些植物幼芽、胚轴、茎尖

10、分生组织等外植体现已建立了一些植物幼芽、胚轴、茎尖分生组织等外植体诱导形成直接分化芽再生体系。诱导形成直接分化芽再生体系。优点：优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定；周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定；缺点：缺点：材料局限，转化率低。材料局限，转化率低。3.原生质体再生系统原生质体再生系统原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。的再生受体系统之一。优点：优点：高效、广泛地摄取外源高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得或遗传物质，获得 基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合基因型一致的克隆细胞，所获转基

11、因植株嵌合 体少，适用于多种转化系统；体少，适用于多种转化系统；缺点：缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。不易制备、再生困难和变异程度高。154.胚状体再生系统胚状体再生系统 是指经体细胞培养形成的在形态结构和功能上类是指经体细胞培养形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构，又称体细胞胚。似于有性胚的结构，又称体细胞胚。优点：优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力 强，嵌合体少，易于培养、再生。强，嵌合体少，易于培养、再生。缺点：缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。技术含量高，多数植物不易获得胚状体。5.生殖细胞受体系统生殖细胞受体系统

12、以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。的系统。一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统；转化受体系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法、花粉粒浸泡法、子房微针注射法等。管导入法、花粉粒浸泡法、子房微针注射法等。优点：生殖细胞不仅具有全能性，而且接受外源遗传优点：生殖细胞不仅具有全能性，而且接受外源遗传 物质的能力强，导入外源基因成功率高，更易物质的能力强，导入外源基因

13、成功率高，更易 获得转基因植株。又因生殖细胞是单细胞，转获得转基因植株。又因生殖细胞是单细胞，转 化的基因五显隐性影响，外源目的基因充分表化的基因五显隐性影响，外源目的基因充分表 达。因此利用生殖细胞作为转基因受体与单倍达。因此利用生殖细胞作为转基因受体与单倍 体育种技术相结合，可简化和缩短育种纯化过体育种技术相结合，可简化和缩短育种纯化过 程。程。缺点：获得单细胞只能在开花期，常受到季节及生长缺点：获得单细胞只能在开花期，常受到季节及生长 条件的限制。条件的限制。 第四节第四节 植物遗传转化的载体系统植物遗传转化的载体系统一、载体的概念一、载体的概念 载体载体（vector）:将外源基因送入

14、受体细胞的工具将外源基因送入受体细胞的工具 本质是一段本质是一段DNA分子分子,是指能在连接酶作用下和外源是指能在连接酶作用下和外源DNA片段或基因连接片段或基因连接，并运送，并运送DNA分子进入受体细胞的分子进入受体细胞的DNA分子。分子。二、载体的功能二、载体的功能 作为植物基因转化的载体，必须具有两种功能：作为植物基因转化的载体，必须具有两种功能： 一是一是它能作为媒介将外源基因导入到植物细胞中去，并且整它能作为媒介将外源基因导入到植物细胞中去，并且整合到宿主细胞的基因组合到宿主细胞的基因组DNA上上 二是二是它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所

15、识别的DNA序序列，即启动子和复制子起始位点，以保证转化的外源基因能列，即启动子和复制子起始位点，以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复制和表达。在植物细胞中进行复制和表达。四、植物基因工程常用载体四、植物基因工程常用载体 质粒(plasmid)； 病毒载体(virus vector)； 噬菌体(phage)； 酵母载体(yeast vector)；以以病毒载体病毒载体和和质粒载体质粒载体介导的遗传转化比较多。介导的遗传转化比较多。 五、五、Ti质粒质粒 有一种土壤细菌有一种土壤细菌,称为农杆菌，它称为农杆菌，它能诱导植物伤口形成能诱导植物伤口形成冠瘿瘤冠瘿瘤，细菌的，细菌的致瘤能力来源于细

16、菌内的一个额外染致瘤能力来源于细菌内的一个额外染色体即质粒色体即质粒(plasmid)，称，称Ti质粒。质粒。 还有一种细菌称发根农杆菌还有一种细菌称发根农杆菌,决定决定毛根症毛根症的质粒为的质粒为Ri质粒质粒，即诱发寄主植，即诱发寄主植物产生毛根物产生毛根 . Ti和和Ri质粒质粒是理想的基因克隆载体，是理想的基因克隆载体，通过它们可以将外源的通过它们可以将外源的DNA转移到植物转移到植物细胞，并再生出能够表达外源基因的细胞，并再生出能够表达外源基因的转基因植物。转基因植物。 Ti质粒是根癌农杆菌染质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状共价闭合的环状

17、DNA分子，分子，约有约有150-200kb大小。在病大小。在病原菌致病过程中，其中的一原菌致病过程中，其中的一段段DNA分子（分子（T-DNA）能够）能够插入到植物基因组中并能够插入到植物基因组中并能够稳定表达。稳定表达。 致毒区 Ti质粒复制起始点 冠瘿碱代谢 酶编码基因 与Ti质粒转移功能 有关的遗传座位 冠瘿碱合成基因 T-DNA区 右边界 生长素合成基因 细胞分裂素合成基因 左边界 根据其诱导的植根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，瘿碱种类不同，Ti质粒质粒可以被分成四种类型：可以被分成四种类型：章鱼碱型章鱼碱型胭脂碱型胭脂碱型农杆碱型农杆碱型农杆菌素

18、碱型农杆菌素碱型（或称琥珀碱型）（或称琥珀碱型） 致毒区 Ti质粒复制起始点 冠瘿碱代谢 酶编码基因 与Ti质粒转移功能 有关的遗传座位 冠瘿碱合成基因 T-DNA区 右边界 生长素合成基因 细胞分裂素合成基因 左边界 不同类型的不同类型的Ti质粒都具有质粒都具有:（1）TDNA区（区（transferred-DNA regions）：）： T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时是农杆菌侵染植物细胞时，从，从Ti质粒上切割下来转移到植物质粒上切割下来转移到植物细胞的一段细胞的一段DNA，故称之为转移，故称之为转移DNA。该。该DNA片段上的基因与肿瘤片段上的基因与肿瘤的形成有关。的形成有关。（2）V

19、ir区（区（virulence region）：）： 该区段上的基因能激活该区段上的基因能激活T-DNA转转移，使农杆菌表现出毒性，故称之移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。为毒性区。T-DNA区与区与Vir区在质粒区在质粒DNA上彼此相邻，合起来约占上彼此相邻，合起来约占Ti质质粒粒DNA的三分之一。的三分之一。 致毒 区 Ti质 粒复 制 起始 点 冠瘿 碱 代谢 酶编 码 基因 与Ti质粒 转移 功 能 有关 的 遗传 座 位 冠瘿 碱 合成 基 因 T -DNA区 右边 界 生长 素 合成 基 因 细胞 分 裂素 合 成基 因 左边 界 （3）Con区（区（regions enco

20、ding conjugations）：）： 该区段上存在着与细菌间接该区段上存在着与细菌间接合转移相关基因（合转移相关基因（tra），调），调控控Ti质粒在农杆菌之间的转移质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活。冠瘿碱能激活tra基因，诱基因，诱导导Ti质粒转移，因此称之为接质粒转移，因此称之为接合转移编码区。合转移编码区。（4）Ori区（区（origin of replication）：）： 该区段基因调控该区段基因调控Ti质粒的自质粒的自我复制起始。我复制起始。 致毒区 Ti质粒复制起始点 冠瘿碱代谢 酶编码基因 与Ti质粒转移功能 有关的遗传座位 冠瘿碱合成基因 T-DNA区 右边界 生长

21、素合成基因 细胞分裂素合成基因 左边界 第五节第五节 基因转导方法基因转导方法将目的基因导入受体细胞（植物细胞将目的基因导入受体细胞（植物细胞）农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法 遗传转化分为遗传转化分为两种两种：一种是一种是生物载体生物载体介导的遗传转化；介导的遗传转化；一种是一种是非生物载体非生物载体介导的遗传转化。介导的遗传转化。就非载体转化而言，该系统又可以分为两种类型：就非载体转化而言，该系统又可以分为两种类型：种质转化系统种质转化系统和和直接转化系统直接转化系统。种质转化系统：以植物自身的生殖系统种质细胞，如花粉种质转化系统：以植物自身的生殖系统种质细

22、胞，如花粉粒通道法。粒通道法。直接转化系统：不用任何载体，采用物理化学方法直接将直接转化系统：不用任何载体，采用物理化学方法直接将外源基因导入受体细胞，如基因枪法、脂质体法、超声波外源基因导入受体细胞，如基因枪法、脂质体法、超声波法等。法等。1、农杆菌介导的基因转移、农杆菌介导的基因转移（1）农杆菌转化的寄主范围）农杆菌转化的寄主范围 根癌农杆菌和发根农杆菌的寄主范围很广，目前已知有根癌农杆菌和发根农杆菌的寄主范围很广，目前已知有90多科、多科、600余种植物可以感染。如烟草、大豆、棉花、马铃薯、油菜、花生、余种植物可以感染。如烟草、大豆、棉花、马铃薯、油菜、花生、番茄、苹果、杨树等用农杆菌转

23、化都先后获得成功。遗憾的是大部分番茄、苹果、杨树等用农杆菌转化都先后获得成功。遗憾的是大部分单子叶植物很少或完全不能产生激活单子叶植物很少或完全不能产生激活Ti质粒质粒Vir区基因的信号分子。为区基因的信号分子。为了克服根癌农杆菌转化单子叶植物的障碍，许多研究者对感染的合适了克服根癌农杆菌转化单子叶植物的障碍，许多研究者对感染的合适部位和转化方法进行了探讨，并发现乙酰丁香酮和其它酚类化合物可部位和转化方法进行了探讨，并发现乙酰丁香酮和其它酚类化合物可促进大麦、小麦等很多单子叶植物的转化。经过不懈努力，科学家用促进大麦、小麦等很多单子叶植物的转化。经过不懈努力，科学家用农杆菌转化重要的单子叶植物

24、如水稻、玉米、小麦等都取得了成功。农杆菌转化重要的单子叶植物如水稻、玉米、小麦等都取得了成功。一、载体介导的转化方法一、载体介导的转化方法 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒介导的转基因方法是目前研究最多、机理最清质粒介导的转基因方法是目前研究最多、机理最清楚、技术方法最成熟的转基因方法。第一批表达外源基因的转基因植楚、技术方法最成熟的转基因方法。第一批表达外源基因的转基因植物就是用根癌农杆菌介导法获得的。迄今所获得的物就是用根癌农杆菌介导法获得的。迄今所获得的200多种转基因植多种转基因植物中，物中，80%以上是利用根癌农杆菌以上是利用根癌农杆菌Ti质粒介导的转基因方法产生的。质粒介导的转基因方法

25、产生的。 农杆菌转化首先要求植物外植体能够产生乙酰丁香酮或农杆菌转化首先要求植物外植体能够产生乙酰丁香酮或其它能够诱导其它能够诱导Vir区基因的活性物质。区基因的活性物质。 其次是农杆菌能够接近具有再生能力的感受态细胞。其次是农杆菌能够接近具有再生能力的感受态细胞。（2）农杆菌转化的方法）农杆菌转化的方法 可用于农杆菌转化的外植体种类很多，从单细胞（通可用于农杆菌转化的外植体种类很多，从单细胞（通常是原生质体）、悬浮培养细胞和愈伤组织（未分化的胚常是原生质体）、悬浮培养细胞和愈伤组织（未分化的胚性细胞）、薄壁细胞层、组织切片（如萝卜韧皮部和马铃性细胞）、薄壁细胞层、组织切片（如萝卜韧皮部和马铃

26、薯块茎薄壁组织）到各种植物器官，如叶、根、茎和花组薯块茎薄壁组织）到各种植物器官，如叶、根、茎和花组织的切段等。织的切段等。 基因转移技术的一般操作基因转移技术的一般操作 以根瘤农杆菌转化双子叶植物叶片为例以根瘤农杆菌转化双子叶植物叶片为例1.将表面消毒的叶片切成小块将表面消毒的叶片切成小块2.小块在过夜培养并稀释到一定浓度的根癌农杆菌液中浸泡小块在过夜培养并稀释到一定浓度的根癌农杆菌液中浸泡几分钟，以便让根癌农杆菌感染叶片切块的伤口。几分钟，以便让根癌农杆菌感染叶片切块的伤口。3.从菌液中捞出小块，培养基中培养从菌液中捞出小块，培养基中培养2天。天。4.在含头孢霉素选择培养基中筛选转化细胞。

27、继续培养，转在含头孢霉素选择培养基中筛选转化细胞。继续培养，转化的细胞分化出芽。化的细胞分化出芽。5.将芽转入含有抗生素的生根培养基上，诱导生根。将芽转入含有抗生素的生根培养基上，诱导生根。6.将完整的转基因植株移栽到土壤中。将完整的转基因植株移栽到土壤中。 该方法是该方法是Marton等等1979年以原生质体为受体建立起来的，年以原生质体为受体建立起来的，随后经过一系列的改进，现在是植物基因工程中最常用的一种随后经过一系列的改进，现在是植物基因工程中最常用的一种转化方法。该方法的主要原理是将受体与供体在一起培养，通转化方法。该方法的主要原理是将受体与供体在一起培养，通过接触感染而发生转移，供

28、体常用农杆菌、病毒载体等形式。过接触感染而发生转移，供体常用农杆菌、病毒载体等形式。 A.原生质体原生质体共培养法共培养法 取含重组取含重组TiTi质粒的农杆菌同刚刚长出细胞壁的原生质体质粒的农杆菌同刚刚长出细胞壁的原生质体作短暂的共培养，促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物质作短暂的共培养，促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物质的转化。的转化。从烟草无菌苗中分离原生质体，并预培养从烟草无菌苗中分离原生质体，并预培养24小时。小时。原生质体与农杆菌混合培养，原生质体浓度原生质体与农杆菌混合培养，原生质体浓度l05ml、农杆农杆菌菌l07ml，20下保温下保温32小时。小时。冲洗去游离的细菌，将原生

29、质体培养在有抗生素冲洗去游离的细菌，将原生质体培养在有抗生素(250mgL万古霉素，万古霉素，200mgL羧苄青霉素，羧苄青霉素，200mgL链霉素链霉素)的培的培养基中，这些抗生素抑制细菌生长，而对原生质体无毒害。养基中，这些抗生素抑制细菌生长，而对原生质体无毒害。3周后，离心收集细胞团，再培养在无激素培养基上，周后，离心收集细胞团，再培养在无激素培养基上，2周周内，转化的细胞团是激素非依赖性生长细胞团，在该培养基中内，转化的细胞团是激素非依赖性生长细胞团，在该培养基中可快速生长，而非转化的细胞团则生长很慢，最后变褐死亡。可快速生长，而非转化的细胞团则生长很慢，最后变褐死亡。 烟草原生质体与

30、烟草原生质体与Ti质粒转移的共培养法程序为质粒转移的共培养法程序为：B.B.叶盘共培养法叶盘共培养法 图 该方法最早由该方法最早由Horsch(1985)首创，首创，并已被成功地用于烟草、番茄、矮牵牛并已被成功地用于烟草、番茄、矮牵牛和杨树等植物的转化。其步骤是用打孔和杨树等植物的转化。其步骤是用打孔器取得器取得叶圆片（直径叶圆片（直径2-5毫米），毫米），在过夜在过夜培养并调整到合适浓度的培养并调整到合适浓度的农杆菌菌液中农杆菌菌液中浸泡浸泡4-5分钟分钟，置于培养基上，置于培养基上共培养共培养23天天，在转移到含有选择剂的培养基上，在转移到含有选择剂的培养基上，使转化细胞直接再生植株。叶圆

31、片法经使转化细胞直接再生植株。叶圆片法经过改良可以用于茎段、叶柄和萌发种子过改良可以用于茎段、叶柄和萌发种子等其它外植体的转化。等其它外植体的转化。优点：适用性广，对于那优点：适用性广，对于那些能被农杆菌感染的、并些能被农杆菌感染的、并能从叶子再生植株的各种能从叶子再生植株的各种植物均适用。植物均适用。 把转化外植体，如茎段、幼胚、悬浮培养细胞等农杆把转化外植体，如茎段、幼胚、悬浮培养细胞等农杆菌在一起培养菌在一起培养2448h，用无菌水冲洗数次，洗去农杆菌，用无菌水冲洗数次，洗去农杆菌，将材料转入含有抑菌剂（如将材料转入含有抑菌剂（如cefotaxime等）的培养基中培等）的培养基中培养，选

32、择转化体。养，选择转化体。C.共培养法共培养法 原则上，该种共培养与原生质体共培养的方法和步骤原则上，该种共培养与原生质体共培养的方法和步骤是相同的，在供体上，则必须是有侵染和感染能力的载体是相同的，在供体上，则必须是有侵染和感染能力的载体系统，如带有系统，如带有Ti质粒的根癌农杆菌。质粒的根癌农杆菌。 又称整体植株接种转化法，又称整体植株接种转化法，是指人为地在整体植株上是指人为地在整体植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤表面，或用针头造成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤表面，或用针头把农杆菌注射到植物体内，使农杆菌按照天然的感染过把农杆菌注射到植物体内，使农杆菌按照天然的感染过 程程

33、在植物体内进行侵染，获得转化的植物愈伤组织或转基因在植物体内进行侵染，获得转化的植物愈伤组织或转基因植株。接种后植株。接种后2-3周，切下接种处部分组织培养周，切下接种处部分组织培养4周，可产周，可产生愈伤组织，进一步通过分化培养可获得转基因植株。生愈伤组织，进一步通过分化培养可获得转基因植株。D.直接接种法直接接种法优点：优点：方法简便，实验周期短，因培养基不与农杆菌直接方法简便，实验周期短，因培养基不与农杆菌直接接触，故污染较少。接触，故污染较少。 二、二、DNA直接导入的基因转化技术直接导入的基因转化技术 DNA直接导入的基因转化技术：直接导入的基因转化技术：是指不依赖农杆菌载体和其是指

34、不依赖农杆菌载体和其它生物媒体，将外源目的基因直接导入植物细胞，实现基因它生物媒体，将外源目的基因直接导入植物细胞，实现基因转化的技术，又称为转化的技术，又称为无载体介导转化无载体介导转化。这为不易通过农杆菌。这为不易通过农杆菌等载体介导转化的植物提供了外源基因导入的有效途径。等载体介导转化的植物提供了外源基因导入的有效途径。根据根据DNA导入机理可分为：导入机理可分为：化学法：化学法：是以原生质体为受体，借助特定的化学物质诱是以原生质体为受体，借助特定的化学物质诱导导DNADNA直接导入植物细胞的方法。目前主要有直接导入植物细胞的方法。目前主要有PEGPEG法和脂法和脂质体法。质体法。 物理

35、法：物理法：是基于许多物理因素对细胞膜的影响或通过机是基于许多物理因素对细胞膜的影响或通过机械损伤直接将外源械损伤直接将外源DNADNA导入细胞。原生质体、细胞、组织导入细胞。原生质体、细胞、组织及器官均可作为外植体，比化学法更具广泛性和实用性。及器官均可作为外植体，比化学法更具广泛性和实用性。常用的方法有基因枪法、超声波法、电击法等。常用的方法有基因枪法、超声波法、电击法等。 1、物理方法、物理方法（1）基因枪法）基因枪法 80年代末期，由康奈尔大学的年代末期，由康奈尔大学的Sanford最先提出，主要最先提出，主要是为了克服以往各种基因转化技术的局限。是为了克服以往各种基因转化技术的局限。

36、该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。 操作技术程序为：操作技术程序为：基因枪示意图基因枪示意图 首先将钨、金微粒首先将钨、金微粒(直径直径约约0.4m，重量约重量约0.05mg)与与供体供体DNA溶液溶液(12ll)混合混合并保温，使并保温，使DNA吸附在金属微吸附在金属微粒的表面，然后将该溶液置于粒的表面，然后将该溶液置于所谓的所谓的“基因枪基因枪”仪器中，仪仪器中，仪器高压放电将金属微粒加速，器高压放电将金属微粒加速，直接喷射受体原生质或细

37、胞，直接喷射受体原生质或细胞，细胞击穿成孔后，在钨粒上的细胞击穿成孔后，在钨粒上的DNA以及溶液中的以及溶液中的DNA都可都可以进入受体细胞。以进入受体细胞。 基因枪所用材料：基因枪所用材料：（1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。（2）将）将DNA包被到微载体上所用的试剂有亚精胺、包被到微载体上所用的试剂有亚精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等，但多用前两种。异丙醇等，但多用前两种。（3）所用

38、动力系统：一类以火药爆炸力作为动力加速微弹；另一类以电弧）所用动力系统：一类以火药爆炸力作为动力加速微弹；另一类以电弧放电蒸发液滴作为动力；第三类以高压蒸汽作为动力。放电蒸发液滴作为动力；第三类以高压蒸汽作为动力。基因枪法的特点：（基因枪法的特点：（1）转化效率高。）转化效率高。 （2）受体广泛。）受体广泛。（3）操作简单。）操作简单。基因枪法缺点与农杆菌介导法比，转化效率低与农杆菌介导法比，转化效率低形成的嵌合体多形成的嵌合体多结果的重复性差结果的重复性差遗传稳定性差遗传稳定性差仪器昂贵成本高仪器昂贵成本高若与农杆菌法结合，可提高转化效率若与农杆菌法结合，可提高转化效率（2）电激法电激法(e

39、lectroperation) 又称电穿孔发，是利用高压电脉冲的作用对原生质体或细胞击出微孔而使又称电穿孔发，是利用高压电脉冲的作用对原生质体或细胞击出微孔而使基因转移的一种新方法。基因转移的一种新方法。 原理：原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电位（位（Vm）约为约为l00mV，导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，升高，双分子层两端电压形成差势，随着外加电场电压升高

40、，细胞膜被压缩变薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿，形成短暂性可逆性的开闭通道，外源当膜电压升到一定数值时，膜被击穿，形成短暂性可逆性的开闭通道，外源DNADNA进入细胞。进入细胞。 电转仪电转仪（3）微注射法（）微注射法（micro-injection） 微量注射：用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔，微量注射：用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔，DNA随穿刺孔进入随穿刺孔进入细胞或随穿刺针头细胞或随穿刺针头道进入。道进入。 真正的显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外源真正的显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNADNA直接注入细胞直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法

41、。质或细胞核的基因转化方法。 直接注射法直接注射法：是用注射针直接将大量的：是用注射针直接将大量的DNA注入注入植物组织或器官达到转化的目的，如子房、分蘖节植物组织或器官达到转化的目的，如子房、分蘖节、幼穗等，又称宏量注射法。、幼穗等，又称宏量注射法。 在注射过程中，针尖往往摧毁了被注射的细胞在注射过程中，针尖往往摧毁了被注射的细胞，因此该法试图利用与被注射细胞邻近的组织细胞，因此该法试图利用与被注射细胞邻近的组织细胞吸收外源吸收外源DNA。（4）激光微束法）激光微束法(laser microbeam) （5）超声波法）超声波法 此方法是利用直径很小、能量很高的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔的原

42、理，此方法是利用直径很小、能量很高的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔的原理，在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源代替荧光光源，聚焦后发出在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源代替荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔，处于细胞周围的外源激光微束脉冲，造成膜穿孔，处于细胞周围的外源DNA分子随之进入细胞。分子随之进入细胞。基本原理：是利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使外源基本原理：是利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使外源DNA进入细胞。进入细胞。 利用利用超声波处理可避免脉冲高压对细胞的损伤作用，有利于原生质体的存活，是超声波处理可避免脉冲

43、高压对细胞的损伤作用，有利于原生质体的存活，是一种有潜力的转化途径。一种有潜力的转化途径。（6）离子束法）离子束法 离了束作用在生物表面后可引起电子溅射，离子束的溅射好象一把手术刀，对生离了束作用在生物表面后可引起电子溅射，离子束的溅射好象一把手术刀，对生物体进行微细加工，使生物体表面层层剥离，原来不连通的通道在一定距离内连物体进行微细加工，使生物体表面层层剥离，原来不连通的通道在一定距离内连通，后来的离子就可穿行较长的距离，落在预定的位置上。通，后来的离子就可穿行较长的距离，落在预定的位置上。 （7）碳化硅纤维介导）碳化硅纤维介导DNA转移法转移法 是简单、快速、经济的导入是简单、快速、经济

44、的导入DNA进入植物完整细胞的方法。进入植物完整细胞的方法。 应用直径为应用直径为0.6微米、长度为微米、长度为10-80微米的碳化硅纤维，使附微米的碳化硅纤维，使附着于纤维或细胞壁上的着于纤维或细胞壁上的DNA，借助与在漩涡震荡引起的相互碰，借助与在漩涡震荡引起的相互碰撞过程中纤维对细胞的穿刺作用进入细胞，实现转化。撞过程中纤维对细胞的穿刺作用进入细胞，实现转化。（8）DNA卵育法（又称浸泡法）卵育法（又称浸泡法）利用供体利用供体DNA溶液与受体的种子、幼胚、幼穗、及幼苗溶液与受体的种子、幼胚、幼穗、及幼苗等器官的接触，使外源等器官的接触，使外源DNA进入受体细胞内，然后与受进入受体细胞内，

45、然后与受体细胞基因组重组，产生转化效果。体细胞基因组重组，产生转化效果。方法：浸种、浸苗、浸胚、浸芽方法：浸种、浸苗、浸胚、浸芽特点：简单、快速、方便特点：简单、快速、方便2化学方法化学方法 （1）PEG法法 是细胞融合剂，它可以使细胞膜之间是细胞融合剂，它可以使细胞膜之间或或DNA与膜之间形成分子桥，促使相互之间与膜之间形成分子桥，促使相互之间的接触和粘连，即具有细胞粘合作用；的接触和粘连，即具有细胞粘合作用；PEG还可以引起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间还可以引起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，因而能促进原生质体融合和改变细的识别，因而能促进原生质体融合和改变细胞膜的通透性，从而有利于外

46、源胞膜的通透性，从而有利于外源DNA进入原进入原生质体，实现基因遗传转化。生质体，实现基因遗传转化。 脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜结构，可将成的膜结构，可将DNA包在其内，并通过包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬过程，把外源吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内。转运到细胞内。(2)脂质体法脂质体法3.花粉管通道法（花粉管通道法（pollen-tube pathway system） 原理是授粉后使外源原理是授粉后使外源DNA能能沿花粉管渗入，经过珠心通道进沿花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊

47、，转化尚不具备正常细胞入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。壁的卵、合子或早期胚胎细胞。花粉管通道法转化实质是受精过花粉管通道法转化实质是受精过程转化。花粉粒在柱头上萌发形程转化。花粉粒在柱头上萌发形成花粉管，不断向胚囊伸长，滴成花粉管，不断向胚囊伸长，滴注在柱头上的外源注在柱头上的外源DNA随着花粉随着花粉管进入胚囊管进入胚囊 。花粉管通道法是由周光宇等花粉管通道法是由周光宇等(1978)建立并在长期科学研究建立并在长期科学研究中发展起来的。中发展起来的。通过花粉管通道常用的外源基因导入方法通过花粉管通道常用的外源基因导入方法A.柱头滴注法柱头滴注法 将外源将外源DNA溶液

48、直接滴于授粉后溶液直接滴于授粉后2-3小时的柱小时的柱头上，或将授粉后柱头切除一部分，在切除头上，或将授粉后柱头切除一部分，在切除处花粉管孔处滴加外源处花粉管孔处滴加外源DNA。B.花粉粒与外源DNA混合授粉法 将将DNA溶液与适量新鲜花粉迅速混合成糊状，溶液与适量新鲜花粉迅速混合成糊状，立即涂在柱头上，套袋隔离至种子成熟。或立即涂在柱头上，套袋隔离至种子成熟。或将将DNA溶液涂在柱头上，然后立即将采集的溶液涂在柱头上，然后立即将采集的花粉洒落在柱头上。花粉洒落在柱头上。C.花粉粒培养法花粉粒培养法 取新鲜的花粉洒落在柱头上，待萌发时取下取新鲜的花粉洒落在柱头上，待萌发时取下加入外源加入外源D

49、NA溶液中混均后在涂在柱头上。溶液中混均后在涂在柱头上。D.花粉粒转化法花粉粒转化法 又称花粉携带发，先用农杆菌、基因枪、微又称花粉携带发，先用农杆菌、基因枪、微注射等方法将外源注射等方法将外源DNA导入花粉粒，涂在柱导入花粉粒，涂在柱头上。头上。第六节第六节 转化植株的检测与鉴定转化植株的检测与鉴定外源目的基因转化频率低外源目的基因转化频率低 如何选择和筛选转化体是一个重要问题。如何选择和筛选转化体是一个重要问题。 50一、选择标记基因一、选择标记基因 外源目的基因转化频率低，目的基因已被整合到核基因外源目的基因转化频率低，目的基因已被整合到核基因组并表达转化细胞更少，使用组并表达转化细胞更

50、少，使用特异性选择标记基因特异性选择标记基因（selectable marker genes）进行标记，）进行标记，有效地选择出真有效地选择出真正转化细胞。正转化细胞。 表达载体的组成表达载体的组成1.目的基因目的基因2.启动子启动子3.终止子终止子4.标记基因标记基因原理：原理：选择标记基因的主要功能是该基因的产物给选择标记基因的主要功能是该基因的产物给予植物细胞一种选择压力，致使未转化细胞在施用予植物细胞一种选择压力，致使未转化细胞在施用选择剂条件下不能生长、发育与分化，而转化细胞选择剂条件下不能生长、发育与分化，而转化细胞对该选择剂产生抗性，不影响其生长、发育，从而对该选择剂产生抗性，不

51、影响其生长、发育，从而将转化细胞及植株选择出来。将转化细胞及植株选择出来。必须具备以下四个条件：必须具备以下四个条件：编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；基因较小，可构成嵌合基因；基因较小，可构成嵌合基因；能在转化体中得到充分表达；能在转化体中得到充分表达；检测容易，并且能定量分析。检测容易，并且能定量分析。54 常用选择标记基因：常用选择标记基因： 编码抗生素的抗性基因编码抗生素的抗性基因 编码除草剂的抗性基因编码除草剂的抗性基因 将选择标记基因与适当启动子构成嵌合基因，克将选择标记基因与适当启动子构成嵌合基因，克隆到质粒载体上，与目的基因同时进行转化。标

52、记基隆到质粒载体上，与目的基因同时进行转化。标记基因在受体细胞表达，使转化细胞具有抵抗相应抗生素因在受体细胞表达，使转化细胞具有抵抗相应抗生素或除草剂的能力而存活下来。非转化细胞则被抑制、或除草剂的能力而存活下来。非转化细胞则被抑制、杀死。杀死。 常用选择标记基因：常用选择标记基因： 编码抗生素的抗性基因编码抗生素的抗性基因:新霉素磷酸转移酶基因新霉素磷酸转移酶基因II（nptII），），编码新霉素磷酸转移酶编码新霉素磷酸转移酶II（nptII），抗代谢物（选择剂）为卡），抗代谢物（选择剂）为卡那霉素（那霉素（Kanr）、新霉素（）、新霉素（Neor）、氨基葡萄糖苷（）、氨基葡萄糖苷（Aphr

53、）。）。 编码除草剂的抗性基因编码除草剂的抗性基因 ：PPT乙酰转移酶基因（乙酰转移酶基因（Pat），又），又称称bar基因，编码基因，编码PPT乙酰转移酶，抗草丁膦、双丙氨膦。乙酰转移酶，抗草丁膦、双丙氨膦。 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源体，即带有异源DNADNA分子的受体细胞。否则，如分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基果将转

54、化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。认哪一个克隆含有转化的质粒。二、报告基因：二、报告基因： 植物基因工程中，常采用另一类标记基因来检测植物基因工程中，常采用另一类标记基因来检测转化的目的基因是否在受体植物细胞组织中得到表达，转化的目的基因是否在受体植物细胞组织中得到表达，给转化细胞带上一种标记，起报告和识别作用，故称给转化细胞带上一种标记，起报告和识别作用，故称报告基因报告基因。 理想的植物报告基因应具备以下特征：理想的植物报告基因应具备以下特征：A.编码的产物是唯一的，并对宿主植

55、物细胞无毒性编码的产物是唯一的，并对宿主植物细胞无毒性B.表达产物及产物的类似功能在未转化的植物细胞表达产物及产物的类似功能在未转化的植物细胞 内不存在内不存在C.产物表达水平稳定产物表达水平稳定D.便于检测便于检测 n冠瘿碱基因（nos、ocs）nGus基因(-葡糖苷酸酶基因)nCat(氯霉素乙酰转移酶基因)n(GFP)绿色荧光蛋白基因 报告基因报告基因: Gus基因（基因（-葡萄糖苷酸酶基因）葡萄糖苷酸酶基因） Gus基因是一种报告基因。报告基因系指其编码产物能够基因是一种报告基因。报告基因系指其编码产物能够被快速测定的一类基因，常用来检测转基因的瞬间表达。被快速测定的一类基因，常用来检测

56、转基因的瞬间表达。 Gus基因来源于细菌，其功能是编码基因来源于细菌，其功能是编码葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶(glucuronidase，GUS)，该酶能催化许多，该酶能催化许多葡萄糖苷酯葡萄糖苷酯类物质的水解。绝大多数的植物细胞内不存在内源的类物质的水解。绝大多数的植物细胞内不存在内源的GUS活性，因而活性，因而Gus基因被广泛用作转基因植物的报告基因。基因被广泛用作转基因植物的报告基因。 用于用于GUS检测的常用底物有三种：检测的常用底物有三种： 5溴溴4氯氯3吲哚吲哚D葡萄糖苷酸酯葡萄糖苷酸酯(XGluc) 4甲基伞形酮酰甲基伞形酮酰D葡萄糖醛酸苷酯葡萄糖醛酸苷酯(4MUG) 对硝基苯对硝

57、基苯D葡萄糖醛酸苷葡萄糖醛酸苷(PNPG) 葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶(GUS)检测上具检测上具有以下特点：有以下特点：GUS与与X-Gluc底物发生底物发生作用，产生蓝色沉淀，既作用，产生蓝色沉淀，既可以用分光光度计法测定，可以用分光光度计法测定，又可以直接观察到植物组又可以直接观察到植物组织中形成的蓝色斑点。织中形成的蓝色斑点。当加入当加入4MUG及及PNPG，发黄色荧光，用荧光光谱发黄色荧光，用荧光光谱法测定（法测定（=465nm）。由）。由于荧光强度高，本底低，于荧光强度高，本底低，故荧光检测极为灵敏。故荧光检测极为灵敏。葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶(GUS)检测上检测上具有以下特点：具有以

58、下特点：检测容易、迅速并能定检测容易、迅速并能定量，只需少量植物组织抽量，只需少量植物组织抽提液即可在短时间内测定提液即可在短时间内测定完毕。完毕。价格便宜。价格便宜。 GFP（绿色荧光蛋白基因）（绿色荧光蛋白基因）LUC（萤火虫荧光素酶基因）（萤火虫荧光素酶基因）报告基因报告基因:三三.外源基因整合的分子检测外源基因整合的分子检测PCR检测检测 利用利用PCR扩增检测外源基因整合时，要以被检组织扩增检测外源基因整合时，要以被检组织DNA为模板，以外源基因序列设计引物进行扩增，然后用琼脂糖为模板，以外源基因序列设计引物进行扩增，然后用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。若被检植株基因组凝胶电泳分离扩增

59、产物。若被检植株基因组DNA中含有外源中含有外源基因，则可得到扩增产物，琼脂糖胶上就会出现特异性扩增基因，则可得到扩增产物，琼脂糖胶上就会出现特异性扩增的条带。非转化植株基因组的条带。非转化植株基因组DNA中不含有外源基因，则无特中不含有外源基因，则无特异性扩增条带出现。异性扩增条带出现。 注意：注意：PCR扩增可以扩增选择标记基因，也可扩增目的扩增可以扩增选择标记基因，也可扩增目的基因。标记基因的存在并不能完全代表目的基因的存在基因。标记基因的存在并不能完全代表目的基因的存在 PCR反应包括三个步骤：反应包括三个步骤： 变性：变性：在在94-9594-95使模使模板板DNADNA的双链变性成

60、单链。的双链变性成单链。 复性复性：两个引物分别与两个引物分别与单链单链DNADNA互补复性，复性的互补复性，复性的温度在温度在50-6050-60 延伸延伸：在引物的引导及：在引物的引导及TaqTaq酶的作用下，于酶的作用下，于7272合合成模板成模板DNADNA的互补链的互补链 这三个步骤称为一个循环，这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有反应常有25-35个循环。个循环。 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外是体外快速扩增快速扩增DNA的方法的方法 PCR产物可以通过产物可以通过电泳检测电泳检测琼脂糖电泳琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝