应用ROC曲线评价耐甲氧西林葡萄球菌的检测方法

1、应用ROC曲线评价耐甲氧西林葡萄球菌的检测方法摘nbsp;要nbsp;目的:nbsp;nbsp;通过对耐甲氧西林葡萄球菌(MRS的常用检测方法及实验条件进行评价，选择特异性和敏感性较 nbsp;nbsp;好的方法和理想的实验条件。方法：nbsp;nbsp;以PCR法检测葡萄球 菌的mecA基因为“金标准王震，周丽萍， 刘智成，庄建伟，汪海青 摘 要 目 的：通过对耐甲氧西林葡萄球菌(MR$的常用检测方法及实验条件进行评价，选择特异性和敏感性较好的方法和理想的实验条件。方法： 以PCF法检测葡萄球菌的mecA基因为“金标准”，比较PBP2a交乳凝集试验法、头抱 西丁( FOX琼脂筛选法、苯唑西林

2、(OXA琼脂稀释法(MIC)、FOX纸片扩散 法、OXA琼脂筛选法、OXA纸片扩散法检测MRS勺敏感性和特异性。同时应用 ROC曲线对实验方法及不同的实验条件进行评价。结果：PCR法共检出79株mecA基因阳性菌株，阳性率为73.8%。以PCR法为“金标准”，上述6种 方法的 ROC曲线下面积分别为0.994，0.964，0.955，0.946，0.932，0.862。结论： 选择最佳实验条件，用两种表型检测方法作平行检测，对可疑 结果用PBP2a交乳凝集试验或PCR法确诊。关键词 耐甲氧西林葡萄球菌 ; 药敏实验 ; 评价Application of ROC curve in theeval

3、uation of the methods for detectionof methicillin-resistantstrains of staphylococciWANG Zhe，n ZHOU Li-ping ， LIUZhi-cheng ， ZHUANG Jian-wei， WANG Hai-qing(1.Department ofClinical Laboratory ， the Second People ' s Hospital of Zhenjiang，Zhenjiang Jiangsu 212002;2. Department of Molecular Biol-ogy

4、，School of Medical Technology ， Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu212001;3. Department Nosocomial Infection Control， theSecondPeople' s Hospital of Zhenjiang， Zhenjiang Jiangsu212002， China )Abstract Objective： To evaluate of sixtests for detection of methicillin-esistant strains of staphyloc

5、occi. Then choosed the better methods and conditions for clinical experiment. Methods： To compare the sen-sitivity and thespecificity of the PBP2a latex agglutination method， efoxitin agarscreening method ， oxacillinagar dilution method( MIC)，cefoxitin disk diffusion method， oxacillin agar screening

6、 test andoxacillin diskdiffusion method for detecting of MRS using PCRamplification mecA gene as “ gold standard ” . Receiver op - erating characteristic( ROC) curve was drawn ， and the area under the curvewas calculated. Results： Therewere 79 isolates showing mecA-positive among 107 staphylococcal

7、isolates by PCR， the rate was73.8%. The area under ROC curve of the six methods was 0.994，0.964， 0.955， 0.946， 0.932， 0.862 respectively.Conclusion： Foradvancing the sensitivity and the specificity， two methods should betested simultaneously.If the results were conflicting， the PCRassay or PBP2a lat

8、ex agglutination test for detection of MRS should be operated.Key wordsMRS;antimicrobialsusceptibility test;evaluation近年来，随着广谱抗菌药物的应用，耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS的分离率逐渐增高、耐药 性不断增强 1，据报道该菌对苯唑西林的耐药率达 70%以上 2，因此，对临床分离的葡萄球菌进行耐甲氧西林葡萄球菌（MRS检测具有非常重要的临床意义。目前临床实验室对 MRS的常用表型检测方法有苯唑西林（OXA纸片扩散法、OXA琼脂稀释法（MIC）、OXA琼脂筛选法，2

9、004年美国临床实验室标准化委员会（NCCLS推荐使用含30卩g /片的头抱西丁（FOX进行纸片扩散试验3，也有报道用FOX琼脂筛选法进行检测4。而判断MRS勺“金标准”，仍是PCR法检测葡萄球菌mecA基因，或检 测该基因编码的青霉素结合蛋白（PBP 2a，但由于实验条件限制及试剂价格昂 贵，这两种方法在一般基层实验室难以开展。而表型检测法仍然是大部分实验室的首选方法，但其实验影响因素较多，且各实验室之间检测条件及判断标 准不一，使结果缺乏可比性。本文对 107株临床送检标本中分离的 CNS以PCR 法扩增mecA基因片段作为“金标准”，对不同实验条件下的多种表型检测方法 进行检测，利用RO

10、C曲线进行综合评价。1材料和方法1.1 材 料1.1.1 菌株来源葡萄球菌临床分离株 107株，从 2005年 1 月至 2006年 6月期间由本室及江苏大学 附属 医院检验科、江苏大学附属人民医院检验科从临床标本中留取，所有菌株按全 国临床检验操作规 程第二版鉴定到种，包括表皮葡萄球菌 51 株、溶血葡萄 球菌 16株、腐生葡萄球菌 10株、人葡萄球菌 6 株、模仿葡萄球菌 5株、头 状葡萄球菌 5株、耳葡萄 球菌 4株、华纳葡萄球菌 4株、孔氏葡萄球菌 3 株、木糖葡萄球菌 3 株。质控菌株为金黄色葡萄球菌 ATCC 25923（ MSSA）、 ATCC2921（MSSA，购于浙江杭州天和

11、微生物有限公司。JS0405 （MRSA由江苏省临床检验中心程梅老师提供。1.1.2试剂及仪器OXA纸片（1 卩 g/ 片），FOX纸片（30 卩 g/ 片），Mueller-Hinton（MH 琼脂为Oxoid 公司商品。OXA FOX抗生素标准品购于中国药品生物制品检定所;抗PBP2aK乳凝集试剂为法国生物梅里埃公司商品（批号：796773801） ;PCR所需的各种试剂均为TAKARA公司商品，引物参照文献由宝生物工程（大连）有限公司合成5， P1:5 5 -GTA GAA ATG ACT GAA CGT CCG ATA A3', P2:5 5 -CCA ATT CCA CAT

12、TGT TTC GGT CTA A-;仪器: Hettich- UNIVERSAL 16型 低温高速离心机，德国Mastercycler Perso nal 5332型PCRT增仪。1.2方法1.2.1 OXA纸片扩散法采用 K-B 法，把 0.5 麦氏单位浊度的菌悬液分别均匀涂布于普通 M-H琼脂以及加入1% 2% 3% 4% NaC1的 M-H琼脂表面上，贴 OXA氏片（1 卩g/片），置30E和35C于24 h和48 h两个时点孵育后，对着透射光线仔 细观察，测量抑菌环直径，CNS以18 mm为敏感，w 17 mm 为耐药。质控菌 株为金黄色葡萄球菌ATCC259231.2.2 OXA琼

13、脂稀释法将0.5 麦氏单位浊度的 菌悬液用无菌生理盐水 10倍稀释后，接种在 OXA 浓 度（卩 g/ml ）分别为 0.125，0.25，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，1.0， 2.0，4.0，6.0，8.0并含2% NaCl的MH琼脂上，接种量大约为 104 CFU, 35C培养24 h，仔细观察，判定MICo质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC292131.2.3 OXA琼脂筛选法将0.5麦氏单位浊度的菌悬液分别点种在 OXA浓度为 0.40, 0.50, 0.60，0.70，0.80，1, 2, 4，6卩g/m1并含4%NaC的MH®脂上，35 C培养48 h

14、，仔细观察，只要有一个菌落生长即判为阳性。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213用不同OXA浓度所检测的结果，计算ROCS线下面积，选择面积最大时的 OXA浓度作为琼脂 筛选法的最适药物浓度。1.2.4 FOX 纸片扩散法采用普通M-H琼脂，培养温度为35 C,其他操作同苯唑西林纸片扩散法。判断标准：CNS以抑菌环直径25 mm为敏感，w 24 mm为耐药。质控菌株为金黄色葡萄球菌 ATCC 25923。1.2.5 FOX 琼脂筛选法参照文献 4进行。头抱西丁的浓度分别为1, 2, 4, 8, 16卩g/m1。平板上只要有一个菌落生长即判为MRS1.2.6抗PBP2at乳凝集法操作严格按说

15、明书进行。1.2.7 PCR 反应 参照文献 5操作，以 310 bp处 出现区带判为mecA基因阳性。金黄色葡萄球菌ATCC25923( MSSA为阴性对照， JS0405(MRS)A 为阳性对照。1.3 统计学处理采用SPSS10.0统计软件绘制ROCS线并计算曲线下面积。本文以OXA琼脂稀释法为例作图，其他方法图略。2结果2.1 mecA基因及PBP2a检测结果107株CNS中检出mecA基因阳性为79株，阴性28株。阳性检出率为73.8%。以mecA基因 检测结果作为“金标准”,PBP2at乳凝集法的敏感性为98.7%(78/79)，特异性为100% (28/28 )。其ROCS线下面

16、积为0.994。2.2 OXA纸片扩散法检测结果孵育24h与48 h的结果基本一致；相同条件下30 C比35 C特异性高；用不同NaCI 浓度的MH 琼脂置30E孵育24 h检测，其ROCS线下面积分别为：S普通 MH =0.734， S1%NaCI=0.807， S2%NaCI=0.862 ， S 3%NaCI =0.843，S4%NaCl=0.8302.3 OXA琼脂稀释法检测结果按CLSI / NCCLS 2005 标准 6, CNS以 MIC <0.25 卩 g/m1 为敏感，0.50 卩g/m1为耐药作为判断标准，有2株MIC处于0.25和0.50卩g/m1之间，而无法判断其敏

17、感性。去除该 2 株后的敏感性为 98.7%(76/77)，特异性为 75.0% (21/28 )。通过ROCS线发现本次OXA琼脂稀释法的折点为0.70 卩g/m1，其曲线下面积为0.955，见图1。如果以w 0.25卩g/m1为敏感， >0.70卩g/m1为耐药作为判断标准，有 13株MIC处于0.25和0.70卩g/m1 之间，而无法判断其敏感性，去除该 13株后敏感性为 98.6% (71/72) ，特异 性为95.5% (21/ 22 )。2.4 OXA琼脂筛选法检测结果OXA浓度分别为 0.40, 0.50, 0.60 , 0.70 , 0.80 ,1 , 2,4, 6 卩

18、g/m1 时，ROC曲线下面积为 0.869 , 0.856 , 0.879 , 0.932 , 0.862 , 0.818 , 0.799 , 0.729 , 0.729。在 0.70 卩 g/m1 时，ROCS线下面积最 大。有文献报道最佳药物浓度分别为 0.75卩g/m1和4卩g/m1 7, 8。2.6 FOX琼脂筛选法检测结果含1, 2,4, 8, l6卩g/m1头抱西丁的琼脂筛选法，其 ROCS线下面积分别是0.607 , 0.750 , 0.964 , 0.812 , 0.754。以含4卩g/m1头抱西丁时的 ROCS线下面积最 大。与文献报道的结果一致4。2.7 6种MRS表型检

19、测法结果比较见表1。表1 6种MRS表型检测法结果比较(略)3讨论近几年MRCN的检出率及耐药率逐年增高1,本研究结果也显示 MRCN的检出率高达73.8%。国内外关于MRS勺检 测方法报道较多，但 由于实验条件不一，各实验室之间的检测结果缺乏可比 性8-12。表型检测法及实验条件的选择将直接影响到结果的准确性，应引 起临床实验室关注。本研究对目前常用的MRS佥测方法及部分实验条件进行评价，结果显示，以PCR法作为“金标准”，PBP2a8交乳凝集试验的敏感性及特 异性最高，ROCS线下面积最大（0.994）;经不同含药浓度的FOX琼脂筛选法 试验，以4卩g/m1作为最佳药物浓度时，ROCS线下

20、面积最大（0.964 ）;在 OXA琼脂稀释法中，以0.50卩g/m1作为耐药的判断标准时，会出现假阳性率偏高的情况，本次实验用 ROCS线得其折点在0.70卩g/m1，ROC曲线下面 积为0.955，如果以0.70卩g/m1作为耐药的判断标准，其特异性有所提 高，但是会出现较多结果处于中介值而无法判断；由于FOX在体外能诱导PBP2a 的产生9，敏感性及特异性较高，且结果易读，FOX纸片扩散法被作为MRS佥测的首选表型检测法，本次实验中，其ROCS线下面积为0.946;OXA琼脂筛选法中OXA浓度为0.70卩g/m1时，ROCS线下面积最大（0.932 ），与有 关文献一致7，有文献报道最佳

21、药物浓度为4卩g/m1 8，这是否与菌株 的地区差异有关，需进一步探讨；OXA纸片扩散法是临床实验室鉴定 MRS勺常用 方法，但由于该法影响因素多，从表型上进行诊断，其结果有时不够准确，致 使其特异 性低于其他方法。本次实验在不同温度，不同孵育时间的情况下， 用含不同NaCI浓度的MH琼脂进行试验，以30E，孵育24 h，NaCl浓度为2%寸的ROC曲线下面积最大（0.862 ）。综上结果，作者认为各实验室应根 据自己的情况，选择合适的检测方法，标化实验条件，并选用两种以上的方法 进行检测。比如，本实验室采用头孢西丁纸片扩散法和苯唑西林（ 0.70 卩g/m1）琼脂筛选法作为表型检测方法，当两

22、种方法的结果出现不一致时，再 用PBP2aK乳凝集试验确定。从而在提高敏感性和特异性的同时，可以降低成 本和减轻工作量。参考文献 1 吕火祥，沈禧琼，潘立勇，等.19972001年耐甲氧西林葡萄球菌临床分离率及耐药性分析 J . 检验医学， 2004， 19（ 3） :220-224. 2 Diekema DJ， PfaIIer MA ， Schmitz FJ ， et a1.Survey of in-fections due to StaphyIococcus species:frequency of oc-currence andantimicrobiaI susceptibiIity o

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