丙泊酚对小鼠成肌细胞自噬的影响及其机制的研究

1、丙泊酚对小鼠成肌细胞自噬的影响及其机制的研究近年的研究说明 , 丙泊酚不仅在动物的脓毒症休克中有保护作用 , 在器官和 细胞的缺血 / 再灌注 I/R 、氧化应激损伤中同样有保护作用。丙泊酚对心肌细 胞和海马细胞的保护作用就表现为保护心肌细胞和海马细胞对抗 I/R 的自噬性 细胞死亡。包括丙泊酚、七氟烷在内的全麻药都会上调骨骼肌的自噬行为 , 这种自噬现 象在全麻过程中呈时间依赖性逐渐上调 ,并在六小时时到达顶峰 , 且去神经支配 与全麻状态缺一不可。但是 , 关于丙泊酚发挥对自噬的促进作用是通过何种更具 体的分子机制 , 以及是否能够对实际的临床用药有指导意义的相关研究很少。自噬是胞质溶胶和

2、细胞器被隔离到双层膜的小泡中后运送到溶酶体 / 空泡中 降解, 并使形成的大分子进行再循环的一个过程。 自噬过程发生时 , 细胞会消化掉 自身的一局部 , 即 self-eating, 这个过程初一看似乎是不利于细胞的。但事实上, 如果没有诱发因素存在 , 正常情况下细胞只维持较低程度的自噬 以维持自稳。而所谓的诱发因素 , 既有来自于细胞外的诸如外界中的营养成分不 足、缺血、缺氧、生长因子的浓度的变化等 ,也有来自于细胞内的 , 比方细胞内的 代谢压力、衰老或破损的细胞器堆积、蛋白质折叠错误或异常聚集等。但是在细胞存活和生长的过程中 , 这些因素是经常存在的 , 因此, 正常情况下 细胞保持

3、了一种很低的、 根底的自噬活性以维持自稳 , 同时, 自噬在机体的细胞成 分更新,组织代谢 , 生长和发育等一系列重要的生命根本进程中发挥着非常重要 的生物学作用。在疾病形成的过程中自噬同样扮演着非常重要的角色 , 包括神经 退行性疾病 ,Danon 肌病等许多疾病的发生、开展都与自噬关系密切。自噬本身是一种保护性的生理过程 ,确保细胞稳态以及细胞内功能协调 , 然 而自噬过度激活那么会造成严重的细胞结构和功能的破坏 , 因此我们不能简单地定 义自噬对于生物体的利弊。有研究说明 , 内质网应激和自噬相互影响的关系对于 骨骼肌疾病中肌纤维损伤的发生开展非常重要。内质网应激依赖性的肌细胞死亡和肌炎

4、以及 dysferlin 相关的营养不良肌 病的肌细胞损伤有关。 内质网应激是由于蛋白合成过度增加 , 错误折叠蛋白增多 , 细胞内钙含量不平衡 ,糖、能量缺乏 ,局部缺血等潜在的病理生理干扰素增加 ,内 质网稳态遭到破坏失衡 , 进而产生的一种细胞对于外界不良因素的保护性应答机 制。目前的研究主要集中在胰腺和脂肪组织中 , 而在骨骼肌中研究并不多。内质 网适应性的应答机制有 : 第一 unfolded protein response UPR。UPR激活可以上调 3 ER membrance-associated protein 、PERK IRE1 以及 ATF6蛋白表达,使之合成增加,同

5、时伴侣蛋白的基因和蛋白表达也会增加,例如 BIP/Grp78以及Grp94,在内质网应激发生的过程中表达会上调。 内质网应激激活 之后释放内质网腔内的钙离子到细胞质中 , 激活钙依赖性细胞通路。细胞内钙离子增加,钙离子激活CaMKIK ,激活MAP通路激活自噬。同时,细 胞内钙离子增加,增加的钙离子会激活PKCs磷酸化，进而诱导LC3转移对TG TN 刺激的内质网应激产生应答。也就是说, 细胞内钙离子增加与内质网应激在激活自噬的过程中有协同作用。 此外, 内质网将大量钙离子释放到细胞质内 , 会引起线粒体肿胀 ,破坏呼吸链功能 , 也会增强自噬的进程。第二,ER overload respon

6、se EOR。EOR可以通过上调 NF- k b 通路相关蛋 白的表达 , 以及调节炎症应答来发挥其保护作用如果EORffi UPF都没有被激活,那么细胞在不良的外界环境中将进入程序性细胞死亡的阶段。丙泊酚在不同的组织器官中以及肿瘤细胞中发挥的保护作用 , 这 种保护作用也与MAPK1路,NF- k B等有密切联系。丙泊酚可能是通过调节细胞内钙离子流量调节线粒体功能和脑内代谢以发 挥其保护作用。包括丙泊酚在内的全麻药在大鼠的麻醉中会促进骨骼肌自噬。基于以上的事实 , 丙泊酚对骨骼肌细胞自噬的促进作用 , 是否是通过内质网 应激来发挥作用值得探讨，需要深入研究。本文以小鼠成肌细胞C2C12为研究

7、 对象, 探讨了丙泊酚对真核生物正常细胞自噬的作用及其机制 , 为丙泊酚的作用 机制提供新的研究思路。方法：1分别用不同浓度的丙泊酚0卩M 25卩M 50卩M 100卩M 150 卩 M 250 卩 M 300 卩 M 400 卩 M 500 卩 M 600 卩 M 700 卩 M 800 卩 M 900 卩 M 处理小鼠成肌细胞C2C12 48h。CCK8法检测不同浓度丙泊酚对分化的小鼠成 肌细胞C2C12生存率的影响。分别用不同浓度的丙泊酚400卩M 900卩M处理分化的小鼠成肌细胞C2C12 3h,通过流式细胞仪用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞内ROS勺变化。2为了检测丙泊酚对自噬的作用,

8、分别用不同浓度的丙泊酚50卩M 100卩M 200卩M 400卩M处理分化的小鼠成肌细胞C2C12不同时间段：3h,6h,24h 。通过RT-PCR法、Western Blot方法和免疫组织化学进行检测,分别检测自 噬相关蛋白 LC3 p62 Beclin-1 基因和蛋白表达水平的变化 , 同时检测 mTOR p-mTOR AMP K p-AMPK勺蛋白表达水平的变化。自噬抑制剂氯喹二磷酸盐 ，可以 抑制蛋白水解酶的作用 ,从而抑制自噬自噬的后期阶段 ,即抑制自噬溶酶体降解 ,为了进一步确认丙泊酚的自噬的作用及对自噬流的影响 ,用丙泊酚与自噬抑制剂 氯喹二磷酸盐联合处理分化的小鼠成肌细胞 C2

9、C12,Western Blot 方法检测 LC3和p62的表达以确定自噬激活情况，通过流式细胞仪用流式细胞术检测细胞 凋亡水平的变化确定自噬在丙泊酚对细胞存活率的作用的影响。3为了检测丙泊酚促进自噬的作用是否通过内质网应激来发挥作用, 用丙泊酚400卩M和内质网应激抑制剂牛磺酸去氧熊胆酸TUDC1mM联合处理 小鼠成肌细胞C2C12 3h,用荧光染料H2-DCFDA标记活性氧簇RO$ ,用流式 细胞术检测细胞内ROS水平的变化，并通过高内涵成像分析系统分析细胞内 ROS 水平的变化；用荧光染料Rhod-2am标记细胞内的钙离子,用高内涵成像分析系统 分析药物处理后三个小时内不同时间段,细胞内

10、Ca<sup>2+v/sup平的变化； 用Western Blot方法检测自噬相关蛋白LC3p62表达情况的变化,以及内质网 应激标志蛋白Bip、CHOP勺变化。4为了检测丙泊酚促进自噬的作用与活性氧 簇ROS的水平升高是否有相关性,丙泊酚400卩M和ROS卬制剂N-乙酰半 胱氨酸NAC 3mM处理小鼠成肌细胞C2C12 3h,通过流式细胞仪检测细胞凋 亡和细胞内ROS勺变化。用 Western Blot 方法检测自噬标记蛋白 LC3、 p62 的变化。结果 1.丙泊酚 对细胞增殖能力的影响低浓度小于 300卩M表现为促进，而高浓度&gt;300 卩M时那么表现为抑制,90

11、0卩M的丙泊酚会引起细胞凋亡，但不是通过活性氧簇 ROS 增加发挥作用。2.丙泊酚上调自噬相关蛋白 LC3、 p62、 Beclin-1 的基因表达水平和蛋白表 达水平,上调AMPK/p-AMP比率,同时下调mTOR/p-mTO比率,且这种作用呈现出 浓度依赖性。丙泊酚对自噬的促进作用与对照组相比 ,3 小时检测时比较显著 ,6小时根本没有差异 ,24 小时没有检测到明显的变化3.丙泊酚与自噬抑制剂氯喹二磷酸盐CQ共同孵育细胞时，自噬标记蛋白 LC3-II和p62的表达相较于丙泊酚单独处理或 CC单独处理时增加更为显著。4. 丙泊酚与内质网应激抑制剂牛磺酸去氧熊胆酸TUDCA或者ROS卬制剂N

12、-乙酰 半胱氨酸NAC共同孵育时，都会减弱丙泊酚对自噬的促进作用。并且在丙泊酚单独处理细胞时显著上升的自噬标记蛋白Bip、CHOP在丙泊酚与内质网应激抑制剂TUDCA共同作用时,表达水平也会显著下调。在对钙离子 进行不同时间段的检测时发现 , 丙泊酚刚处理细胞两个小时之内 , 相对于对照组 钙离子显著增加 , 两个小时到三个小时之间 , 钙离子水平显著下调 , 内质网应激抑 制剂单独处理或者与丙泊酚共处理的细胞的钙离子水平 , 在检测的三个小时小时 之内变化不明显；相对应的，丙泊酚单独处理细胞时,ROS水平显著增加，而内质 网应激抑制剂TUDC或者自噬抑制剂3-MA和丙泊酚共处理细胞时,那么可以解除丙 泊酚对ROS水平的促进作用。结论1.丙泊酚细胞毒性