选修一52《多聚酶链式反应扩增DNA片断》课件

1、专题专题5 DNA5 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术 课题课题2 2 多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片断片断. . . 1.1.理解理解PCRPCR的原理和反应过程。的原理和反应过程。( (重、难点重、难点) )2.2.尝试尝试PCRPCR技术的基本操作。技术的基本操作。 3.3.讨论讨论PCRPCR技术的应用。技术的应用。. . . 以“DNA复制”为背景材料，设计问题，导入新课，首先回顾DNA的结构和复制的有关知识，然后了解PCR技术的原理和应用，接着讲解PCR技术的反应过程及具体实验操作步骤，后以视频观看来再次学习实验的知识点。最后通过课堂检测完善所学内容。 通过对PC

2、R反应过程的教学，应以读图识图为主。教材中反应过程图解详细的描绘了参与PCR的各种组成成分；每一轮反应的三个基本步骤变性、复性、延伸；每一步骤的作用。在教学中分析图形的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。. . . DNA复制复制1 1. . DNADNA分子能准确复制的原因有哪些？分子能准确复制的原因有哪些？2 2. .细胞内哪些物质是从头合成的？细胞内哪些物质是从头合成的？3 3. .如果在案件侦破过程中，只收集到一根毛发，如果在案件侦破过程中，只收集到一根毛发， 但但它所含的遗传信息太少，该怎么办呢它所含的遗传信息太少，该怎么办呢? ?. . . 一、一、DNADNA分子的双螺旋结构

3、分子的双螺旋结构 DNA DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为分子是由两条反向平行的（即一条链为3355，另一条链为，另一条链为5 5 3 3 ）脱氧核苷酸）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结长链盘旋而成的规则双螺旋结构构. .脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内基本骨架；碱基排列在链的内侧侧. .两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配与胸腺嘧啶配对对, ,鸟鸟嘌呤一嘌呤一定与胞定与

4、胞嘧啶配嘧啶配对对. . . . 二、二、DNADNA的复制的复制2 2、时期、时期有丝分裂有丝分裂间期间期 减数减数第一次分裂前的间期第一次分裂前的间期3 3、场所、场所细胞核（主）、线粒体、叶绿体细胞核（主）、线粒体、叶绿体4 4、模板、模板DNA母链母链1 1、概念、概念由一个由一个DNA形成两个完全相同的形成两个完全相同的DNA的过程的过程. . . 5 5、原材料、原材料脱氧核苷酸脱氧核苷酸6 6、基本条件、基本条件酶、酶、ATPATP、原料、模板、原料、模板7 7、复制过程、复制过程 DNA DNA的解旋的解旋 亲亲代代DNADNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用分子利用细胞提

5、供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链。链。. . . RNA RNA引物的合成引物的合成 以以单股单股DNADNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNARNA引引物。物。 DNA DNA的生成的生成 以以单股的单股的DNADNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶的作用下，在聚合酶的作用下，在RNARNA引物的末端由引物的末端由55端端33端合成端合成DNADNA。切掉引物生成冈崎片断切掉引物生成冈崎片断 在在核酸酶的作用下切掉引物。在核酸酶的作用下切掉引物。在DNADNA聚合酶的作用

6、下聚合酶的作用下将引物部位换上将引物部位换上DNADNA，此时的，此时的DNADNA片断称为冈崎片片断称为冈崎片断。断。. . . DNA DNA片断的连接片断的连接 在在DNADNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形成连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形成一条完整的新的一条完整的新的DNADNA链。新链与旧链构成新的链。新链与旧链构成新的DNADNA。. . . 边解旋边复制边解旋边复制( (过程）过程）8 8、复制特点、复制特点半保留复制（结果）半保留复制（结果）9 9、遵循原则、遵循原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则. . . 1010、精确复制的原因、精确复制的原因1111、复制的

7、意义、复制的意义 DNA DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性代，从而保持了遗传信息的连续性规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行. . . PCRPCR( (聚合酶链式反应）聚合酶链式反应）1 1、 DNADNA聚合酶特性聚合酶特性不能从头合成不能从头合成DNADNA，只能从，只能从DNADNA的的33端端开始延伸开始延伸DNADNA链，因此，链，因此， DNADNA复制复制需要需要引物。引物。2 2、

8、DNADNA聚合酶作用过程聚合酶作用过程当引物与当引物与DNADNA母链通过碱基互补配对结合后，母链通过碱基互补配对结合后， DNADNA聚合酶就能从引物的聚合酶就能从引物的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，链，DNADNA的的合成方向总是从子链的合成方向总是从子链的55端向端向33端端延伸延伸。. . . 3 3、 PCRPCR原理原理在在8080100100C C的温度范围内，的温度范围内， DNADNA的双螺旋结构将的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变解体，双链分开，这个过程称为变性。性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNADNA链又会重链

9、又会重新结合成双新结合成双链。链。 PCR PCR利用了利用了DNADNA的热变性原理，通过控制温度来控的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的制双链的解聚与结合，现在使用的PCRPCR仪实质上也是仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪一台能够自动调控温度的仪器。器。. . . 高高温解决了打开双链的问题，但是，又导致温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNADNA聚合酶失活的问题，耐高温的聚合酶失活的问题，耐高温的TaqTaq DNA DNA聚合酶解决聚合酶解决了高温导致了高温导致DNADNA聚合酶失活的问题，促成了聚合酶失活的问题，促成了PCRPCR技术技术的自动的自动化

10、。化。4 4、 TaqTaq DNA DNA聚合酶的应用聚合酶的应用5 5、 缓冲液需要为缓冲液需要为PCRPCR反应提供的物质反应提供的物质 DNA DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的四种脱氧核苷酸，耐热的DNADNA聚合酶，同时通过控制聚合酶，同时通过控制温度使温度使DNADNA复制在体外反复进复制在体外反复进行。行。. . . PCR PCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸扩增技年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。术。 它具有特异、敏感、产率高、它具有特异、敏感、产率高、 快速、快速、 简便、简便、重

11、复性好、易自动化等突出重复性好、易自动化等突出 6 6、 PCRPCR技术的特点技术的特点7 7、细胞内和细胞外、细胞内和细胞外DNADNA复制环境的区别复制环境的区别体内体内DNADNA的复制的复制体外的模拟体外的模拟模板（母链）模板（母链）细胞内源细胞内源外源加入外源加入引物引物引物合成酶引物合成酶外源加入外源加入底物底物dNTPdNTP细胞内源细胞内源外源加入外源加入聚合酶聚合酶细胞内源细胞内源外源加入外源加入反应环境反应环境细胞内环境细胞内环境缓冲液缓冲液. . . PCR PCR过程需要的引物不是过程需要的引物不是RNARNA，而是人工合成的，而是人工合成的DNADNA单链，其长度通

12、常为单链，其长度通常为20203030个脱氧核苷酸个脱氧核苷酸8 8、细胞内复制和、细胞内复制和PCRPCR不同点不同点 PCR PCR过程中过程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的对反应温度的控制来实现的. . . PCRPCR的反应过程的反应过程1 1、PCRPCR的反应步骤的反应步骤 PCR PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤个基本步骤变性、复性和延变性、复性和延伸伸. .变性（模板变性（模板DNADNA解旋）解旋） 模模板板DNADNA经加热至经加热至94940 0C

13、 C。一定时间后，使模板。一定时间后，使模板DNADNA双双链或经链或经PCRPCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNADNA解离，使成为单链，以解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作便于它与引物结合，为下轮反应作准备。准备。2 2、循环过程、循环过程. . . PCR PCR 循环第一步循环第一步 ：加热变性：加热变性. . . 复性（退火）复性（退火） 模模板板DNADNA经加热变性成单链后，温度降到经加热变性成单链后，温度降到50500 0C C左右，左右，引物与模板引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结单链的互补序列配对结合。合。. . . PCR PCR 循环第二步循环

14、第二步 ：引物与靶序列退火：引物与靶序列退火. . . 延伸延伸 DNA DNA模板引物结合物在模板引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下以聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNADNA链。链。. . . PCR PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸：引物延伸. . . 第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 ：得到两个拷贝：得到两个拷贝的靶序列的靶序列. . . 循环次数循环次数DNADNA数量数量1 12 22

15、24 43 38 820201,048,5761,048,57630301,073,741,8241,073,741,8243 3、3030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量. . . 4 4、PCR PCR 循环的结果循环的结果 DNA DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNADNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。增。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物板参与反应，并且由引物延伸而成的延伸而成的DNADNA单链会与单链

16、会与引物引物结合，进行结合，进行DNADNA的延的延伸。伸。. . . PCR PCR 的实验操作的实验操作1 1、PCRPCR仪仪（一）设备及用具（一）设备及用具实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器的仪器2 2、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5ml0.5ml3 3、微量移液器、微量移液器用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液体，液体，其上的一次其上的一次性吸液枪头用一次更换一次性吸液枪头用一次更换一次. . . PCRPCR仪仪. . . 1 1、准备、准备2 2、移液、移液（二）实验操作步骤（二）实验操作步骤

17、按照按照PCRPCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌验桌上上. .用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方往微量离心反应体系配方往微量离心管里面加入各种试管里面加入各种试剂剂. . . . 过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁击管壁注注意意: :3 3、混合、混合B B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀应液混合均匀A A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢液体外溢.

18、 . . 将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上，设置好仪上，设置好PCRPCR仪的循环程仪的循环程序序. .过程：将微量离心管放在离心机上过程：将微量离心管放在离心机上, ,离心约离心约10s.10s.4 4、离心、离心5 5、反应、反应离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效反应效果果. . . . 循环数循环数变性变性复性复性延伸延伸第一次第一次9494C C，10min10min3030次次44，30s30s5555，30s30s7272，1min1min最后一次最后一次44，1min1min5555，30s30s7272，1min1min. . . PCR PCR技术技术高度灵敏，高度灵敏，为了避免外源为了避免外源DNADNA等因素的污染而等因素的污染而造成干扰实验，造成干扰实验，PCRPCR操作时要注意做到：操作时要注意做到：隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头. . . 1.标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是() A92、