STARD7真核表达载体的构建及肝癌细胞HepG1-2稳定转染株的建立及鉴定

1、stard7真核表达载体的构建及肝癌细胞hepgl*2稳定转染株的建立及鉴定【关键词】stard7;载体构建;转染satrd7是一编码295个氨基酸残基，分子量为34.7kda的新型蛋白质，其生 物学功能至今未明。通过生物信息学分析，发现其全长序列中含有一个类固醇敏 感性调节蛋白(star)相关脂类转运体结构域(start)o start涉及脂类结合介导 的细胞信号转导、脂类转运和调节。start发生突变或错误表达与基i大i错配、 自身免疫性疾病以及肿瘤相关。为了研究stard7基因过表达后对肿瘤细胞生 物学的影响,我们将stard7基因克隆构建到真核表达载体上,并稳定转染到 hepgp2肝癌

2、细胞中。1.材料和方法1材料:大肠杆菌dh-5a和人肝癌细胞系hepgl*2均由本实验室保 存,pmd18-t载体购口大连宝生物工程有限公司,m-mlv逆转录酶购口 promega 公司，各种分子克隆工具酶购自mbi公司，脂质体lipofectamine2000>trizol试齐！j、 g418和pcdna3()真核表达载体购自invitrogen公司,rpmi1640、胎牛血清(fbs) 等购自gibcobrl公司。1.2方法。121 hcpgl*2总rna的提取。按照trizol试剂说明书步骤提取总rna。 收集所培养的hcpgl*2,加trizol试齐iiml,静置35min。加入

3、氯仿0.5ml,混匀。 室温静置23min后,12000r/min离心15mino于上清中加人0.5ml异丙醇，室温静 置 lomino 10000r/min 离心 lomin。弃上清，加入 750ml/l 乙醇 lml,7500r/min 离 心5min,干燥沉淀，加入30pl depc处理水。经琼脂糖凝胶电泳显示无降解后，用 紫外分光光度计测定其纯度并定量，保存于80°c备用。1.2.2引物设计。根据genbank的基因序列(nm_064536),设计扩增stard7 编码区cdna上、下游引物。上、下游引物中分别引入sami . xhol酶切位点， 扩增 片段为 880bp o

4、 上游 5 ctcgagatggcggcgttagcc 3；下游 5, cccgggagcatactcaatc 3：内参照p-actin的引物序列为：上游59 tgtgacgtggacatccgcaaag 3；下游 5' tggaaggtggacagcgaggc 3；扩增片段为206bpo并设计作为转染hepgl*2细胞后鉴定用的g418抗性基因 pgk neo 的特界性弓i物:上游 5fggatctcctgtcatctcaccttgctcctg 3 下游 5-aagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcg 3：扩增片段为 492bp。 所有引物均由invitrogen公

5、司合成。1.2.3逆转录合成cdna逆转录。反应体系为：细胞总rna 1 |ig,h2o 13|il,oligdt 0.5|ig,70 °c 5min,立刻冰上放置，加入 m-mlv 200u,dntp1 onmol,5xm-mlv buffer 5pl,recombinant rnasin ribonuclease inhibitor 25u,混 匀后42°c lh,70°c lomino取lopl反传录产物进行pcr反应，采用降落 pcr(touch down_pcr),反应条件:94°c 预变性 4min;94°c 变性 30s,63 &

6、#176;c 退火 30s,72°c延伸40s护增35个循环,72°c延伸7min。pcr产物经15g/l琼脂糖凝胶 电泳鉴定后，切胶回收目的片段。1.2.4 t载体克隆。对pcr产物进行割胶纯化,将目的片段与pmd18-t载体 连接。连接反应体系为:solution i 5|il,pmd18-t dna 50ng,pcr 产物 50ng,ddh2o 3pl,置于16°c 2h后，连接产物转化大肠杆菌dh-5a感受态，在氨节青霉素抗性平 板上筛选生长，挑取单克隆菌落。阳性克隆经酶切鉴定，并命名 为:pmd18-t/stard7o1.2.5真核表达载体pcdna3.

7、1()/stard7的构建用sam k xho i分别双酶 切重组pmd18-t/stard7质粒及pcdna3.1(-)空载体，凝胶电泳后冋收口的片 段,16°c连接10ho连接、转化，方法同前。阳性克隆经酶切鉴定后测序(invitrogen 公司)。测序止确后扩大培养,抽提重组质粒dnao1.2.6细胞培养。hepgl*2细胞在含100ml/l胎牛血清的rpmi1640培养液 屮，于3tc、50ml/lco2饱和湿度的孵箱屮培养。1.2.7 hepgl*2细胞的基因转染和筛选培养。将处于对数生长期的hepgl*2 细胞以4x105个细胞/孔接种于六孔板屮，培养24h,使细胞达到8

8、0%90%融合。 用脂质体lipofectamine2000介导空质粒及重组质粒转染细胞。转染前lh先予细 胞更换无血清培养基，使细胞适应条件变更。并准备以下2种溶液,a液:4昭质粒 dna溶于150ml无血清培养液中;b液:4pl脂质体溶于150|il无血清培养液中。 将a液与b液混匀，室温孵育30min?以形成dna脂质体复合体,加入培养液中。 培养814h,更换为完全培养液，继续培养24h,次日于完全培养液屮加入800mg/l 的g418继续进行培养,2周后g418浓度改为400mg/l维持筛选。用选择培养液 培养4周后，分离阳性克隆并扩大培养备用。1.2.8转染后stard7表达的鉴定

9、。分别以p-actin为内参照，对stard7基 因在转染细胞内目的基因的mrna及蛋白表达情况进行鉴定。分别收集稳定转 染空载体重组质粒的细胞，样品处理后进行常规聚内烯酰胺凝胶电泳、转膜、 tbst缓冲液洗膜、50g/l脱脂牛奶封闭。一抗为stard7小鼠多抗，二抗为辣根 过氧化物酶标记的羊抗鼠igqecl显色。2.结果2.1总rna提取。用一步法成功提取hepgl*2总rna,总rna电泳结果可 见有5s、18s和28s三条带。2.2 rt-pcr扩增产物的鉴定及真核表达载体的构建与鉴定。hepgl*2总 rna经rt-pcr扩增,扩增产物电泳结果可见在约880bp处有一特杲性扩增条带 (

10、图2),与预期的扩增片段大小相符。将用sami. xho i双酶切重组质粒 pmd18-t/stard7得到的目的基因插入pcdna 3.1(-)空质粒，获得 pcdna3.1(-)/stard7真核表达质粒，该质粒再经sami、xho i双酶切鉴定，得到了 880bp的目的片段和约5400bp的载体片段(图1),送测序证实该质粒含有完全正确 的 stard7 cdna 序列。图1 rt-pcr扩增产物及重组质粒pcdna3.1(-)/stard7双酶切鉴定m:dl2000 dna marker; 1:pcdna3.1 (-);2:pcdna3.1 (-)/stard7;3:stard7 rt

11、-pcr扩增产物。2.3稳定表达株的筛选与鉴定。将pcdna3()/stard7质粒转染入人肝癌 细胞系hepgl*2,经4周选择性培养(400mg/lg418)后，得到了稳定表达目的基因 mrna的阳性细胞株。采用stard7半定量引物进行rt-pcr扩增,在采用g418 抗性基因pgk neo引物进行的扩增屮，转染pcdna3.1(-)/stard7及pcdna3.1 (-) 空载体的hepgl*2细胞均得到一条人小为492bp的pgk neo条带，而未转染的 hepgl*2细胞没有扩增出该条带，说明pcdna3.1(-)空载体和 pcdna3()/stard7均已转入到hepg1*2细胞屮(图2)。筛选后的stard7稳 定表达细