IgA肾病小鼠模型的建立与鉴定

1、xx年新教师个人总结（二）一年的工作生涯即将宣告结束，作为实习期的一年就这 样很快的过去。从作为学生的校园转到这个作为教师的校园, 角色发生了转变，性质也发生了转变。这突然的转变当然起 先也有过不适应，有过埋怨，有过失败，但更多的是收获， 收获了经验，收获了从理论转化为实践的体验，收获了与学 生的情感。在与学生一年的相处中，体味到了做老师的滋味， 真的是五味杂陈，悲喜交加。这一年，学校让察肾小球系膜细胞及基质变化；电镜法 检测系膜区有无电子致密物沉积；免疫荧光法观察系膜区 iga沉积情况。结果第1 2周末，模型组小鼠均出现不同程 度的血尿；scr、bun较正常对照组显著增高（p【关键词】iga

2、 肾病;模型；血尿；免疫荧光;小鼠abstrac t：objectivetoestab lishmousemodelofiganephropathyinorde ntbasisfortheclini phropathy. methods3 ndomlyassignedinto 10)andthemodelgrou ofiganephropathywa ethodoforalintakeo n(bsa)togetherwithrtoprovideexperime calresearchofigane okunmingmicewerera thecontrolgroup(n= p (n二20).

3、mousemodel sestablishedbythem fbovineserumalbumi injectionofstaphylococcusenterotoxin vein. attheendofthe wasgatheredfortheq ematuria；bloodwast sinusaftereyeballe inetheserumcreatin eanitrogen (bun)；th lcellsandmatrixint vedbylightmicrosco opywasemployedtode depositsinthemesan sionofigadepositio nof

4、luorescencestai area resultsbythee eredifferentdegree lgroupmice bunands upweresignificant1 rmalcontrolgroup(p pathy；model；hematu ncestaining；miceb (seb)viathecaudal 12weeks,freshurine uantitativetestofh akenthroughorbital xtirpationtodeterm ine (scr)andbloodur echangesofmesangia hekidneyswereobser

5、py；electronmicrosc tectelectron-dense gialarea；theexpres nwasmeasuredbyimmu ninginthemesangial ndof12weeks,therew sofhematuriainmode crlevelsinmodelgro yhigherthanintheno keywords：iganephro ria；immunofluoreseiga肾病世界范围内广发的一种系膜增生型肾小球肾炎, 占原发性肾小球疾病的1 0%20%,中国、日本、新加坡等 发病率较高，其中有20%30%的患者进展到肾衰1。建立 与人类临床病理生

6、理相似的iga肾病动物模型，对研究iga 肾病的发病机理、临床治疗等具有重要的作用。本实验采用 口服牛血清白蛋白联合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素的方法 制作iga肾病小鼠模型，为进一步探索iga肾病提供实验依 据。1材料和方法实验材料实验动物昆明种小鼠30只，鼠龄（10-12）周，体重20 26g,雄性，动物编号scxk（苏）xx-0005,由徐州医学院实验 动物中心提供。主要实验试剂和设备牛血清白蛋白（bsa,上海明睿生物有限公司，产品批号rf101-010）；葡萄球菌肠毒素b（seb,北 京博迈世纪生物技术有限公司）；兔抗小鼠iga抗体（北京博 奥森生物技术有限公司，抗体货号bs-0774r）

7、；异硫氟酸荧光 素（fitc）-标记的 羊抗兔 igg （m i 11 iporecorporat ion） ；micromhm340石蜡切片机；光学显微镜（日本carton）；日 本sysmexca-1500自动生化分析仪；电镜（h-600）,切片机 （lkbv 型）o实验方法酸化水的制备新鲜的双蒸水中加入盐酸,浓度为mmol/l。即1000ml双蒸水中加入10%盐酸mlo 1%bsa酸化水的制 备,lgbsa加入100ml酸化水。造模方法适应性喂养1周后，取新鲜尿液进行显微镜下 尿红细胞检测，均为阴性，将30只小鼠随机分为正常对照 组（10只）、模型组（20只）。正常对照组小鼠自由饮水与饮

8、 食；模型组小鼠除自由饮水和饮食外，前5周隔日予bsa（500mgbs a 溶于200mg/kg)灌胃；第 6 周起予 b sa (20mg/kg, 500ml无菌生理盐水中）尾静脉注射，每天1次，连续3天;第8周起予seb（mg/kg, lmgseb溶于25ml无菌生理盐水中） 尾静脉注射，每周1次，连续3周，观察至第12周末。iga肾病小鼠模型的鉴定血、尿液检测第12周末留取小鼠新鲜尿液，行尿红细胞定性检测；经摘眼球取血（待测scr, bun）后,处死小鼠， 留取右侧肾脏分别固定于10%甲醛及戊二醛中，行病理（光镜 和电镜）及免疫荧光检查。光镜检查小鼠肾组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，5n

9、m切片，苏木精-伊红染色（h-e）,光镜下观察系膜区系膜细胞 及基质有无增生。电镜检查取材，前固定，漂洗，后固定，漂洗，脱水，置换 及浸透，包埋及聚合，修块及切片，染色，电镜观察。免疫荧光小鼠肾组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，5um切片依次经二甲苯i 20min,二甲苯ii20min,95%乙醇5min,95%乙醇 ii 5min,双蒸水 5minx 3 次,3%h20210min, pbs 5minx 3 次，抗原修复（微波炉中高火5min,低火15min）,自然冷 却,pbs5minx3 次,5% 羊血清 lh,兔抗小鼠 iga（l : 100）, 4°c 过夜,pbs5minx

10、3,fit c 标记羊抗兔 igg（l : 100）4°c it 夜,pbs5minx3,甘油封片，荧光显微镜下观察摄像。免疫荧光半定量标准：半定量标准参照目前国内通用的5级法（土+）分级: ±：低倍镜下不能显示;+：低倍镜下似乎可见，高倍镜下可 见;+：低倍镜下可见，高倍镜下清晰可见;+：低倍镜下清 晰可见，高倍镜下耀眼;+：高倍镜下刺眼。统计学处理全部数据采用spss医学统计软件进行处理， 计数资料用土s差表示，采用两独立样本t检验；等级资料用 两独立样本非参数检验。p2结果一般情况造模过程中，正常对照组小鼠无死亡，模型组 小鼠先后死亡3只，分析原因可能是灌胃器误插入气

11、管，或 插入过深导致小鼠食管及胃黏膜损伤。尾静脉注射seb后， 小鼠出现倦怠、少吃、少动等现象，2h后恢复正常。血、尿指标检测12周末，采集新鲜尿液光镜下尿红细 胞计数。结果显示模型组小鼠明显高于正常对照组（p镜下结 构改变光镜模型组小鼠肾组织主要表现为肾小球毛细血管祿 扩张，系膜细胞及基质明显增生，毛细血管腔部分闭锁，部 分小管扩张；光镜下正常对照组小鼠肾小球，肾小管，及间 质组织形态结构未见异常，系膜细胞及细胞基质未见增多 （图1）。图112周末，各组小鼠光镜下肾组织病理变化的比较 （it-e 染色，x400）a.模型组，肾小球系膜细胞及基质增生，毛细血管腔部 分闭锁，部分小管扩张;正常对

12、照组，肾小球系膜细胞及基 质未见增生，毛细血管开放良好电镜模型组小鼠肾小球系膜区有大量电子致密物沉积, 而正常组小鼠肾小球系膜区无或有少量的电子致密物沉积 （图2）。图212周末，各组小鼠电镜下肾组织病理变化的比 较（x 10000）a.模型组，系膜区大量的电子致密物沉积;b.正常对照 组，系膜区无电子致密物沉积免疫荧光检测12周末，免疫荧光可以看到，系膜区ig a荧光强度大多为+,而正常组系膜区iga荧光强度 为土+,差异有统计学意义（表3、图3）。表32组小鼠肾 脏系膜区iga荧光半定量比较3讨论自rifai等于1979年首次用balb/c小鼠成功制作iga 肾病模型以来，许多学者基于ig

13、a肾病已知的发病机制成功 复制了许多iga肾病模型2-6 o主要包括：免疫诱导型、继 发病变型、自发病变型。但由于存在种种问题，与人的iga 肾病病理变化差距很大，模型建立的滞后导致对iga肾病的 研究较少，对iga肾病的治疗未获得新的手段。国内常用的iga肾病为异种蛋白所诱导的免疫诱导型, 即口服牛血清白蛋白(bsa)联合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素 (seb) o由于部分患者对某些上呼吸道病原体、肠道菌群、食 物抗原有较高的血清抗体滴度，认为黏膜免疫在发病中起到 一定作用7。故口服免疫原如bsa及静脉注射葡萄球菌、 大肠杆菌、呼吸道病毒等病原微生物成分或免疫复合物常用 于诱导主动性iga肾病模

14、型。bsa 口服免疫可使机体iga抗 体的产生，seb的具体机制目前还不十分明确，大多数认为 seb还可破环肝脏网状内皮系统，引起iga清除不完全，进 而引起免疫复合物在系膜区的沉积。17只模型小鼠荧光证实 全部有iga沉积；光镜下肾小球系膜细胞和系膜基质增生；电 镜下肾小球系膜区可见大量的高电子密度的致密物沉积；临 床的尿、血检测随着肾脏病理变化的加重而逐渐加重，且与 正常组比较差异有统计学意义，说明造模成功。此方法操作 简单，重复性好，成功率高，应该是目前理想的、有研究价 值的动物模型，能为进一步研究iga肾病的发病机制及治疗 提供基础平台。【参考文献】1 donadioj v, gran

15、denephropath y j. nengljmed, 200 2, 347(10)： 738-748.2bagherin,pepple da , hassanmo,etal. developmentofimmunecomplexglomerularinjuryj. labinvest ,xx,85(3):354-363.3jiaq,pestkajj. roleofcyclooxygenase-2indeoxynivalenobulinanephropathy1-inducedimmunoglojfoodchemtoxicol ,xx,43(5):721-728.4koyamaa,sharm

16、ins,sakuraih,etal staphylococcusaureuseel1envelopeantigenisanewcandidatefortheinductionofiganephropathy j. ki dneylnt, xx, 66 (1): 1 21-132.5suzukis,gejyof,nakatomiy,etal. roleofiga,igg,andlgmantibodiesagainsthaemophilusparainfluenzaeantigensinlganephropath yj. clinnephrol,1996,46 (5):287-295.6sharmins,shimizuy,hagiwaram,etal.