BMPsⅡ型突变受体真核表达载体的构建与鉴定

1、bmps ii型突变受体真核表达载体的构建与鉴定【关键词】bmps ii型突变受体关键词：bmps ii型突变受体;真核表达载休0引言骨形成蛋白(bmps)不仅在骨，软骨及与骨骼有关的结缔组织的形成 上有重要作用，而且起着十分重耍的调控作用1 与其他tgf-p超家 族成员一样，bmps在细胞表面与bmp的i , ii型受体相互作用，i型受体 可以和过量的配体结合，而ii型受体与配体的结合则是特异性的2 . tbrk3k为bmps ii型突变受体，其可以阻断bmp的信号转导，这样, bmp就无法发挥其骨诱导及在胚胎发育，器官形成及细胞分化中的作用. 因此，为研究bmps信号转导在组织发育和细胞分

2、化中的作用，我们构建 了 bmps i型突变受体的真核表达载体，为此方面研究的开展奠定了基砒1材料和方法1. 1材料psp64tl-tbrk3k质粒为含有bmps ii型突变受体cdna的克 隆质粒，由日本的nohno教授(kawasaki医学院分子生物所)提供真核 表达载体pcdna3 (neo)购自本校生物化学教研室限制性内切酶及t4dna 连接酶均购口华美公司.dna回收纯化试剂盒购口原平公司.1. 2 酶切鉴定及回收3 将 psp64tl-tbrk3k 和 pcdna3 (neo)用 hindlll和xba i双酶切，经0. 8%琼脂糖凝胶电泳分别得到0. 6,2. 9和5. 4kb

3、的片段,用试剂盒回收纯化0. 6kb和5. 4kb的片段.1. 3连接、转化和克隆筛选3取上述lbrk3k片段5ul和pcdna3（neo）片段各2ul,加入t4dna连接酶、缓冲液和无菌水各1 u l, 16°c连接过夜制备大肠杆菌dh5 a的感受态并转化挑取单个菌落，液体lb培 养基37°c振摇过夜，小提质粒，酶切鉴定筛选出阳性克隆，命名为pc-4.2结果2. 1 psp64tl-tbrk3k 和 pcdna3 的酶切鉴定 psp64tl-tbrk3k 质粒经 双酶切后，得到2.9kb和0.6kb两个片段;pcdna3 （neo）经双酶切后，得 到一个5.4kb的片段，

4、符合二者的物理图谱（图1）图1略2. 2 pc-4的酶切鉴定pc-4经hindlll和xba i双酶切后，得到0. 6kb 和5.4kb两个片段，证明tbrk3k基因已成功连入到pcdna （neo）中（图 1）3讨论tgf-p超家族的成员都结合二种特异受体发挥作用，分别叫做i型受体（约50-55kd）和【型受体（约7080kd） 4 和其他tgf-b超家 族成员一样，bmps在细胞表面与i, ii型受体相互作用 i型受体可以和 过量的配体结合，而ii型受体与配体的结合则是特异性的因此，为研究 bmps信号转导在机体发育中的作用，我们将突变型bmps ii型受体(tbrk3k) 定向克隆到pc

5、dna3 (neo)表达载体中(图2)图2略pcdna3 (neo)可用于在哺乳动物细胞系表达外源基因，全长5. 4kb. 其表达系统构件包括:cmv启动子，sv40复制起始点，sv40polya, sv405' 端和:t端剪切序列等，多聚接头有11个可供利用的单一酶切位点.pc-4真核细胞表达载体可用于研究bmps信号对间充质细胞分化的调 控，对于研究和阐明bmps在机体发育中的作用有重要意义.参考文献：_ 1 wozney jm , rosen v.bone morphogenetic protein and morpho-gcnctic gone family in bone f

6、ormation and repair j .clin or-thop, 1998;346:26-37._2 estevez m, attisano l, wrana jl et al. the daf-4gene encods a bone morphogenetic protein receptor controlling c. elegans dauer larva development j . nature, 1993;365:644-649.3 j.萨姆布鲁克，ef弗里奇，t.曼尼阿蒂斯分子克隆实验指南m 第2版北京：科学技术出版社,1992:34-56.4 held in ch, miyazono k, ten di jke p. tgi7- p