水产动物疾病防治项目八 水产动物疾病检查与诊断技术(樊敏欢)(1)

1、任务8-1 现场调查一、异常现象二、池水理化状态三、饲养管理情况异常现象-当水产动物患病后，通常体色、游动、摄食发生异常变化，出现各种异常现象。（1）活力和游泳行为 患病的个体常离群独游于水面或水层中，活力差，反应也较迟钝；有的在水面上打转或上下翻动，有的侧卧或匍匐于水底。（2）摄食和生长 患病的个体体质消瘦，很少进食；在鱼苗、虾苗、贝苗期，还可观察到消化道内无食物。（3）体色和肢体 患病的个体外表失去光泽，体色暗淡或褪色。鱼类烂鳍、鳞片脱落或竖起等；虾类附肢变红或残缺，甲壳溃疡；贝类外套膜萎缩、足部溃烂或出现脓包等。异常现象微生物疾病：充血、出血、变黑、瘦弱和发炎等症状。寄生虫疾病：烦躁不安

2、、死亡率不高。化学因子： 跳跃、冲撞等兴奋现象。池水理化状态 实地观察养殖环境如池塘的面积、结构、进排水系统、土质和水深等；检查养殖水体的水色是否呈现浓绿、黑褐、污浊，是否有气泡上浮等不良现象；检查养殖水质如透明度、温度、盐度、pH、溶解氧、氨氮是否在养殖水产动物的承受范围；检查池中底泥有无过多的有机物质沉积，使底泥变黑变臭等；还应了解池塘中生物的优势种类和数量。池水理化状态溶解氧低浮头 缺氧泛池酸性水嗜酸性卵藻的爆发 硬度高小三毛金藻大量繁殖鱼中毒死亡重金属弯体病饲养管理情况1、检查养殖池的放养密度是否过大；每天投饵的数量、次数和时间是否适宜；饵料的质量及营养成分是否安全；残余饵料的清除是否

3、及时；换水或加水的数量和间隔的时间是否合理；使用的工具是否消毒等。2、了解水产动物发病的时间，发病率，有无死亡，死亡的数量等；有无进行药物治疗，用药的种类、数量、方法和治疗效果；有无采取其他措施，如灌水或换水；该病过去是否发生过，曾发生的疾病种类、经过等情况。饲养管理情况-向池水投入大量未发酵的人、畜粪便或尿液。池水有机物增多溶解氧鱼缺氧死亡池水有机物增多池水发臭鳃霉病池水有机物增多池水发臭病原微生物-饲养不当长期缺乏饲料水质较瘦萎瘪病、跑马病任务8-2 鱼体检查一、目检二、镜检（一）检查方法：（二）检查部位：一、目检 所谓目检，就是用肉眼对患病个体的体表直接进行观察。观察水产动物体色、体表、

4、附肢、口腔和鳃有无异常；检查体表、鳍（附肢）、鳃、口腔上有无大型寄生虫。体表：体表： 检查鱼体左右两侧。将病鱼或刚死的鱼置于白瓷盘中，按顺序仔细观察。鳃：鳃： 重点检查鳃丝。注意鳃盖是否张开，鳃盖表皮是否腐烂或变成透明。内脏：内脏： 检查肠道为主。剖开后检查是否有腹水和肉眼可见的大型寄生虫。其次检查内脏，肝、胆、鳔等外观是否正常。再进行分离剖检。二、镜检镜检时，取样要有代表性，供镜检的病料能代表一个养殖水体中患病的群体。镜检应按先体外后体内体表、鳃、血液（血淋巴）、消化道、肝（肝胰腺）、脾、肾、心脏、肌肉、性腺的顺序，取下各器官、组织，置于不同的器皿内。从患病个体病变处中刮取黏液或取部分组织，

5、制成水浸片后用光学显微镜检查。对可疑的病变组织或难以辨认的病原体，要用相应的固定液或保存液固定或保存，以供进一步进行病理学诊断。检查方法：1、玻片压缩法 将要检查的器官及组织的一部分或黏液、肠内含物，放在载玻片上，滴入少许清水或生理盐水，用另一玻片将它压成透明的薄层，然后放在解剖镜或低倍镜下检查。2、载玻片法 将要检查的小块组织或小滴内含物放在载玻片上，滴入清水或生理盐水，盖上盖玻片，轻轻地压平后放在低倍镜下检查。检查部位1、黏液 用剖解刀刮取少许黏液，用显微镜或解剖镜检查。2、鼻腔 肉眼观察有无寄生虫或病状，然后用小镊子或微吸管从鼻腔取少量内含物，用显微镜检查。随后用吸管吸取少许清水注入鼻孔

6、中，再将液体吸出，放在培养皿里，用低倍镜或解剖镜观察。3、血液 （1）鳃：鳃动脉取血，直接镜检。 （2）心脏：心脏直接取血，用尖细管插入心脏，吸 取血液。 4、鳃 取出鳃片放在培养皿里，仔细观察鳃上有肉眼可见寄生虫、鳃颜色或其他病象。5、口腔 先用肉眼仔细观察上下颚，观察有无寄生虫。6、体腔 沿腹线剪开鱼腹，再将剪刀移至肛门，朝向侧线，沿体腔的后边剪断，再与侧线平行地向前一直剪到鳃盖的后角，剪断肩带骨，然后再向下剪开鳃腔膜，直到腹面的切口，将整块体壁剪下，体腔里的器官即可显露出来。7. 脂肪先用肉眼观察，如果发现白点，可能是黏孢子虫，须在显微镜下压片检查。8. 胃肠尽量除尽净肠外壁所有的脂肪组

7、织，把肠前后伸直，摆在解剖盘上。有些鱼例如鱅、鲢鱼，肠特别长，可把肠作盘绕壮摆好，先用肉眼检查，肠外壁上往往有许多小白点，通常是黏孢子虫的胞囊。肉眼检查完毕后，把肠分成前（胃）、中、后肠三段，在各段上各取一点，用剪刀开一个小小的切口（与肠平行），用镊子从切口取一小滴内含物放在载玻片上，滴上一小滴生理盐水，盖上玻片。9. 肝先肉眼观察肝脏外表，注意其颜色及有无溃烂、病变、白点和瘤等现象。如果有白点，往往是黏孢子虫或球虫。然后用镊子从肝上取少许组织放在载玻片，盖上盖玻片，轻轻压平，在低倍镜和高倍镜下检查。10. 脾镜检脾脏少许组织，往往可发现黏孢子或胞囊，有时也可发现吸虫的囊蚴。11. 胆囊取出胆

8、囊后，放在培养皿里，先观察外表，注意它的颜色有无变化，有无其他可疑病象等，然后取出一部分胆囊壁，放在载玻片上，盖上盖玻片，压平，放在显微镜下观察。12. 心脏取出心脏放在盛有生理盐水的培养皿里。13. 鰾用镊子剥取鰾的内壁和外壁的薄膜，放在载玻片上排平，滴入少许生理盐水，在显微镜下观察。14. 肾取肾应当完整，分前、中、后三段检查，各查两片。15. 膀胱完整地取出膀胱放在玻片上，没有膀胱的角，则检查输尿管。16. 性腺取出左、右两个性腺，先用肉眼观察它的外表。17. 眼用弯头镊子从眼窝里挖出眼睛，放在玻璃皿或玻片上，剖开巩膜，放在玻璃体和水晶体，在低倍显微镜下检查，可发现吸虫幼虫、黏孢子虫。1

9、8. 脑打开脑腔，用吸管吸出油脂物质，灰白色的脑即显露出来。19. 脊髓把头部与躯干交接处脊椎骨剪断，再把身体的尾部与躯干交接处的脊椎骨也剪断，用镊子从前端的断口插入脊髓腔，把脊髓夹住，慢慢地把脊髓整条拉出来，分前、中、后等部分检查，可发现黏孢子虫和复殖吸虫的幼虫。20. 肌肉首先剖开一部分皮肤，再用镊子把皮肤剥去，用肉眼检查后，先在前、中、后等部分分取一小片肌肉放在载玻片上，盖上盖玻片，轻轻压平，在显微镜下观察，再用压缩法检查。任务8-2 鱼体检查（三）检查注意事项1、用活或刚死的鱼检查2、保持鱼体湿润3、取出的内脏器官除保持湿润外，还要保持器官的完整4、用过的工具要洗干净后再使用5、一时无

10、法确定的病原体或病象要保留好标本任务8-3 细菌性疾病的诊断与病毒的检测一 、细菌性疾病的诊断病原分离纯化培养人工感染病原种类鉴定细菌性疾病的诊断细菌性疾病的诊断一、病料的采集与准备一、病料的采集与准备 采集样本应注意：严格无菌操作，尽量避免标本被杂菌污染；采集处于不同发病时期的样本和健康对照样本；样本必须新鲜，尽快送检；盛装样本的容器中必须加原塘水；对疑似烈性传染病或人畜共患病标本，严格按相应的生物安全规定包装、冷藏、专人递送；样本应做好标记，并在相应检验单中详细填写检验目的、样本种类、临诊诊断初步结果等。二、细菌的分离二、细菌的分离1.细菌形态与结构检查 凡在形态和染色性上具有特征的致病菌

11、（如病鱼脑中的链球菌），样本直接涂片染色（如革兰氏染色法）后，显微镜观察可以进行初步诊断。很多细菌仅凭形态学不能作出确切诊断，需经细菌的分离培养，并进行生化反应和血清学等进一步鉴定，才能明确感染的细菌。2.分离培养 原则上应对所有送检样本做分离培养，获得单个菌落后进行纯培养，从而对细菌做进一步鉴定。分离培养后，根据菌落的形态、大小、颜色、表面形状、透明度和溶血性等对细菌作出初步识别，同时，取单个菌落再次进行革兰氏染色镜检观察。三、病原菌的鉴定三、病原菌的鉴定1. 动物回归试验 将分离的细菌重新感染健康鱼，如果发生同样的症状，且从这些发病的鱼体上能再度分离培养出这种细菌来，则证明分离的细菌为病原

12、菌（柯赫法则，Koch postulates）。2.病原菌的分子诊断 常用的方法主要有PCR技术和核酸杂交技术，具体方法同病毒性疾病的诊断。其中PCR技术常采用细菌的16SrDNA分子鉴定技术，引物为细菌的通用引物（27F：5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 ；1492R：5 AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 3）。但该方法一般只能准确鉴定到属。3. 病原菌的生化鉴定 利用各种细菌的生化反应，可对分离到的细菌进行鉴定。目前，多种微量、快速、半自动和全自动的细菌检测系统和仪器已广泛应用于临诊，能较准确地鉴定出临诊上常见的致病菌。但由于目前这些检测仪器中的细菌数据库主要针对的

13、是人类和哺乳类动物的病原菌，对一些水生动物病原菌的信息没有包含进去，因此，有些时候还需要参考伯吉细菌鉴定手册。4.病原菌的血清学诊断 有些细菌即使进行生化试验也难以鉴别，但可根据其抗原成分（包括菌体抗原、鞭毛抗原）不同，采用血清学方法进行鉴别。利用已知的特异性抗体检测未知细菌抗原，可以确定菌种或菌型。常用的免疫检测技术，有凝集反应、免疫标记抗体技术等。（1）凝集反应 细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在红细胞、乳胶颗粒性载体表面的可溶性抗原，与相应抗体结合，在有适当电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集反应。凝集反应可分为直接凝集试验、间接凝集试验。直接凝集试验A.玻片法

14、主要用于细菌的为定性试验。将含有已知抗体的诊断血清（适当稀释）与待检菌液各滴一滴在玻片上混合，数分钟后，如出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。此法简便、快速。也可用已知的诊断抗原悬液，检测待检血清中是否存在相应抗体，间接判断动物是否被细菌感染。B.试管法 一种定量试验，用以检测血清中是否存在相应抗体和测定血清的抗体效价（滴度），可作临床诊断或流行病学调查。将待检血清用生理盐水作倍比稀释，然后加入等量抗原，置37水浴观察数小时，视不同凝集程度记录为+（100%凝集）、+（75%凝集）、+（50%凝集）、+（25%凝集）和-（不凝集）。间接凝集试验 常用的载体有绵羊红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒等。抗原

15、多为可溶性蛋白质，如细菌裂解物或浸出液、病毒、寄生虫分泌物、裂解物或浸出液，以及各种蛋白质抗原。应用较多的是间接血凝试验和乳胶凝集试验，即以红细胞或乳胶颗粒为载体，将可溶性抗原或抗体致敏于红细胞或乳胶颗粒表面，用于检测相应抗体或抗原。(2)免疫标记抗体技术 主要有免疫荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验等，具体同病毒性疾病的血清学检测。四、药物敏感性试验四、药物敏感性试验 在确定病原菌后，临诊上按常规用药又没有明显疗效时，有必要做抗菌药物敏感试验。药物敏感试验简称药敏试验（或耐药试验）。旨在了解病原微生物对各种抗生素的敏感（或耐受）程度，以指导临床合理选用抗生素药物的微生物学试验。其大致方法是：取含

16、致病菌的液体培养基均匀涂布在固体培养基上，同时将分别沾有一定量各种抗生素的纸片贴在培养基表面，培养一定时间后观察结果。由于致病菌对各种抗生素的敏感程度不同，在药物纸片周围便出现不同大小的抑制病菌生长而形成的“空圈”，称为抑菌圈。抑菌圈大小与致病菌对各种抗生素的敏感程度成正比关系。近年已有自动化的药敏试验仪器问世，使试验更加迅速、准确。任务8-3 细菌性疾病的诊断与病毒的检测二、病毒检测方法1、根据症状诊断2、组织学检测3、电镜检查4、试剂盒等快速诊断一、病料的采集与准备一、病料的采集与准备 一般采集濒死或者出现临床症状的水生动物的组织病料，最好在鱼样本采集之后24h内进行病毒的提取，如果温度保

17、持04在48h以内也可以。把临床样本冷冻贮存在-80-20，可以保存更长时间，但要避免样品的反复冻融。要对已发生的疾病进行诊断，建议最少采集100个幼体标本，50个后期幼体，10个稚体或成体标本。如果临床症状明显，可采集更多的数量。病毒性疾病的诊断病毒性疾病的诊断二、病毒的分离鉴定二、病毒的分离鉴定1.病毒的分离与培养 细胞培养是用于鱼类病毒分离与培养最常用的方法，不同病毒有不同的敏感细胞系，但对于虾蟹类和贝类病毒而言，目前还没有被正式确认的细胞系，因此，虾蟹类和贝类病毒的增殖培养，是用已知的易感宿主进行病毒的体内扩增。常用的鱼类细胞系，主要有鲤上皮瘤细胞（EPC）、大麻哈鱼胚胎细胞（CHSE

18、-214）、胖头肌肉细胞（FHM）、虹鳟性腺细胞（RTG-2）、草鱼性腺细胞（CO）、草鱼肾脏细胞（CIK）、鲇性腺细胞（CCO）、蓝太阳鱼鳃细胞（BF-2）、锦鲤鳍条细胞（KF）、鲈鳍细胞（GF）、鲤脑细胞（CCB）等。（1）病毒的提取 用研钵、研杆或电搅拌器将样品匀浆成糊状，按110的最终稀释度重悬于培养液中，于25下在冷冻离心机中20004 000g，离心15min，收集上清液，加入抗生素。（2）细胞的接种 接种用的细胞必须是24h之内培养的单层细胞。接种量和培养基的容量比例约为110，在40150倍的显微镜下定期观察是否出现CPE（细胞病变效应），如果观察到明显的CPE，可进一步进行病

19、毒的鉴定。CPECPE（细胞病变效应）（细胞病变效应）2.病毒的鉴定（1）病毒形态学鉴定 可通过电子显微镜观察病毒的形态和大小。（2）病毒的血清学鉴定 病毒分离后，可用已知的抗病毒血清或单克隆抗体，对病毒株进行血清学鉴定，以确定病毒的种类、血清型及其亚型。（3）分子生物学鉴定 可采用PCR技术扩增病毒的特定基因，也可采用核酸杂交技术，鉴定分离的病毒。三、病毒感染单位的测定三、病毒感染单位的测定 测定样本中病毒浓度，即病毒滴度，是病毒学中最重要的技术之一。常用于病毒滴度测定的技术，有空斑试验、终点稀释法、荧光-斑点试验和转化试验等，最常用的是前两者。1. 1. 空斑试验空斑试验 空斑试验是一种可

20、靠的病毒滴度测定方法，通过病毒接种细胞上覆盖琼脂限制病毒自由扩散，使病毒只限于感染周围细胞，形成感染病毒的斑点即空斑。通过中性红或结晶紫对感染细胞染色，活细胞可着色，病毒感染死亡细胞则因不能着色而形成透明空斑。根据待测样品的稀释度和空斑数，可计算出单位体积病毒液的空斑形成单位（PFU），得到病毒滴度。 空斑试验是纯化和滴定病毒的重要手段，但有些病毒或毒株不能形成空斑，不适用于空斑测定。空斑试验空斑试验2. 2. 终点稀释法终点稀释法 终点稀释法是用确定病毒对动物的毒力和滴度的重要方法，可测定几乎所有种类的病毒，包括某些不能形成空斑的病毒。通常可选择46个稀释度，接种一定数量的细胞、鸡胚或实验动

21、物，每个稀释度做36个重复。 采用细胞培养测定病毒时，一般用半数感染量（TCID50）作为病毒感染的滴度；用鸡胚或动物测定时，可测定半数致死量（LD50；对于水生动物病毒，一般采用半数致死量（LD50）和半数感染量（TCID50）作为病毒滴度的测定方法。四、病毒感染的血清学诊断四、病毒感染的血清学诊断1.病毒中和试验 根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验称为中和试验，能判定被检血清中的抗体中和病毒的能力中和效价。2.免疫荧光抗体技术 用荧光素对抗体进行标记，然后用荧光显微镜观察荧光，以分析示踪相应的抗原的方法。3.酶联免疫吸附试验（ELISA） ELISA是应用最广、发展最快的一项诊

22、断技术。其原理是用已知酶标抗体检测未知抗原（病毒），包括四种基本方法，即直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。4.免疫转印技术 病毒蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转印到对蛋白质有很强亲和性的滤膜（如硝酸纤维素滤膜）上，经免疫染色（如免疫酶染色）检测结合在膜上的蛋白质。五、病毒感染的分子诊断五、病毒感染的分子诊断1.聚合酶链式反应（PCR）及序列分析 PCR用于DNA病毒的检测，如果是RNA病毒，则需在扩增之前进行反转录。2.核酸杂交 也称为原位杂交，包括DNA杂交（Southern杂交）和RNA杂交（Nouthern杂交）。原理是用

23、标记的病毒核酸序列探针检测结合到滤膜上的病毒DNA或RNA，用于检测DNA病毒或RNA病毒。3.DNA芯片 该技术是将病毒DNA片段有序地固定于支持物（如玻片、硅片）的表面，组成密集二维分子排列，然后与标记的待测样本中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描，对杂交信号的强度进行快速、并行和高效地检测分析，从而可检测样品中靶分子的数量。该技术可用于大批量样本的检测和不同病毒病的鉴别诊断。任务8-4 免疫诊断技术与分子诊断技术一、免疫诊断技术1、凝集反应2、沉淀反应3、补体结合试验4、中和反应5、酶联免疫吸附试验6、免疫荧光技术凝集反应凝集反应一种血清学反应。颗粒性抗原 (完整的病原微生物或红

24、细胞等)与相应抗体结合，在有电解质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。间接凝集反应：反应将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用。免疫沉淀反应主要用于抗原或者抗体的定性检测。其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要包括絮状沉淀试验，环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验。沉淀反应分两个阶段，第一阶段发生抗原抗体特异性结合，第二阶段形成可见的免疫复合物。补体结合试验利用

25、抗原抗体复合物同补体结合，把含有已知浓度的补体反应液中的补体消耗掉使浓度减低的现象，以检出抗原或抗体的试验，为高敏度检出方法之一，特别是根据抗原物质的特性，抗原抗体反应不能用沉淀反应或凝集反应观察时也可以利用此法。中和反应特异性抗体与相应抗原结合后，能抑制抗原的多种生物活性的反应。（毒性、酶活性和病毒感染性等）酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA) ：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。免疫荧光技术将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。任务8-4 免疫诊断技术与分子诊断技术二、分子诊断技术1、聚合酶链反应2、核酸分子杂交技术聚合酶链反应聚合酶链反应或多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），又称无细胞克隆技术，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。1985年美国PE-Cetu