芹菜衔接蛋白基因AgMu2的克隆与表达分析

1、园 艺 学 报 2014，41（7）：13691378 http: / www. ahs. ac. cn acta horticulturae sinica e-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140312；修回日期：20140508 基金项目：国家自然科学基金项目（31272175）；教育部新世纪优秀人才支持计划项目（ncet-11-0670）；江苏省杰出青年基金项目（bk20130027）；江苏高校优势学科建设项目（2011papd）；江苏省双创计划项目（2011jssc） * 通信作者 author for correspondence（e-mail：xiongais

2、heng） 芹菜衔接蛋白基因agmu2的克隆与表达分析 王广龙，王 枫，徐志胜，蒋 倩，谭国飞，熊爱生* （南京农业大学园艺学院，作物遗传与种质创新国家重点实验室，农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，南京 210095） 摘 要：为研究芹菜（apium graveolens）衔接蛋白（adaptor protein）复合体ap-2中的2亚基的功能，以六合黄心芹和美国西芹为试验材料，采用rt-pcr方法获得agmu2基因。序列分析表明：ap-2复合体agmu2基因全长1 317个核苷酸，编码438个氨基酸。推测其蛋白质分子量为49.30 kd，pi为9.28。进化分析表明，来自美国

3、西芹的agmu2亚基在植物间进化具有高度保守性，与葡萄mu2进化关系最为接近。空间结构分析表明，从芹菜中分离的agmu2亚基由5个螺旋和26个延伸主链构成，两个平行的延伸主链构成的平面区域可能含有识别yxx结构的位点。实时定量荧光pcr显示，芹菜中agmu2基因主要在叶中表达，具有明显的组织特异性，同时该基因可响应低温、高温、干旱和盐胁迫等多种逆境信号，2个品种间该基因响应的时间和强度也具有显著的差异，显示了该基因功能的多样性。 关键词：芹菜；ap-2复合体；agmu2基因；克隆；实时定量pcr；基因表达 中图分类号：s 636.3 文献标志码：a 文章编号：0513-353x（2014）07

4、-1369-10 cloning and expression profile analysis of the agmu2 gene of adaptor complex from celery wang guang-long，wang feng，xu zhi-sheng，jiang qian，tan guo-fei，and xiong ai-sheng* （state key laboratory of crop genetics and germplasm enhancement，ministry of agriculture key laboratory of biology and g

5、ermplasm enhancement of horticultural crops in east china，college of horticulture，nanjing agricultural university，nanjing 210095，china） abstract：to investigate the functions of the 2 subunit of adaptor protein complex from celery（apium graveolens），the gene agmu2，encoding the subunit from ap-2 comple

6、x，was isolated from two celery cultivarsliuhe huangxinqinandmeiguo xiqinby rt-pcr method. sequence analysis indicated that the length of agmu2 gene was 1 317 bp，which encoded 438 amino acids. it is predicted that the molecular mass of its protein was 49.30 kd，and pi was 9.28. amino acid sequence com

7、parison showed that the agmu2 frommeiguo xiqinexisted high evolutionary conservation among different species，and its evolutionary relationship was close to grape（vitis vinifera）. analysis on three-dimension structure implied that the subunit was composed with 5 helixes and 26 extended strands. the t

8、yrosine based signal yxx binded to a site on the surface of two parallel -sheet strands. quantitative real-time pcr analysis demonstrated that the agmu2 gene was tissue-specific and mainly expressed in leaf. besides，this gene 1370 园 艺 学 报 41卷 may be involved into response to low temperature，high tem

9、perature，drought，salt stress and a variety of other adverse signals. significant differences also existed in response time and intensity between the two cultivars，revealing the multiple functions of the subunit gene in celery. key words： celery；ap-2 complex；agmu2 gene；clone；quantitative real-time pc

10、r；gene expression 衔接蛋白（adaptor protein，ap）是指在细胞信号传递过程中，在蛋白质间起连接作用的一类蛋白质，其在网格蛋白介导的内吞（endocytosis）过程中发挥重要作用（boehm & bonifacino，2001）。哺乳动物中有两类衔接蛋白，第一类是ap复合体，包括ap-1、ap-2、ap-3、ap-4和最近才发现的ap-5（hirst et al.，2011），第二类是结构相对简单的蛋白因子，如ggas（boman et al.，2000；hirst et al.，2009），stonins（maritzen et al.，2010）等，

11、目前研究较多的是ap-2复合体。研究证实，每个ap-2复合体均为由2个大亚基（和2，约100 kd），1个中亚基（2，约50 kd）和1个小亚基（2，约20 kd）组成的异源四聚体（motley et al.，2006）。ap-2存在于质膜上，在网格蛋白介导的质膜内吞过程中起货物分拣的作用（jackson et al.，2010）。复合体中的和2大亚基主要负责在囊泡膜周围与网格蛋白和其他辅助蛋白建立联系，形成网格蛋白笼，2主要负责ap-2复合体结构的稳定，而中亚基2主要负责识别受体的yxx结构（y为酪氨酸；x可为任意氨基酸；为疏水性氨基酸）（robinson & bonifacino，

12、2001）。有研究表明2亚基所在的ap-2复合体参与多种生物进程，包括细胞生长发育、细胞信号传导以及应对外界环境的刺激等过程（flynn，2001；lacruz et al.，2013）。 与动物和人体中衔接蛋白的研究相比，植物中关于衔接蛋白及其各亚基的报道较少。先前的研究表明细胞膨压并没有阻止植物细胞内吞的发生（gradmann & robinson，1989），这表明植物中也可能存在与动物中类似功能的衔接蛋白。最近的研究发现，拟南芥中纤维素合成酶的内吞过程有2亚基的参与（bashline et al.，2013）。yamaoka等（2013）研究发现ap-2中的2亚基还可能参与拟南

13、芥花器官的发育等过程，kim等（2013）也得到了类似的结论，并认为2亚基可能对拟南芥雄性生殖器官发育有着重要的作用。目前，植物中对衔接蛋白功能研究主要局限在拟南芥中（bashline et al.，2013；kansup et al.，2013；kim et al.，2013；yamaoka et al.，2013），在其他植物中还鲜见关于衔接蛋白组成、结构及其各亚基功能的相关报道。 本试验中以芹菜（apium graveolens）品种六合黄心芹和美国西芹为研究材料，克隆获得芹菜衔接蛋白ap-2的2亚基基因agmu2，并对该基因进行了较为详尽的序列分析，利用实时定量pcr技术对其在不同组织

14、和逆境条件下的表达进行了研究，以期为进一步深入研究、发掘和验证芹菜及其他植物2亚基和衔接蛋白功能奠定基础。 1 材料与方法 1.1 植物材料、菌种与质粒 供试芹菜品种为六合黄心芹和美国西芹，种植于南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室。取3月龄的植株分别进行逆境处理（包括38 高温、4 低温、20% peg干旱和20% nacl盐处理），每个处理6株，处理时间分别为1、2、4、8和24 h时，取植株顶部第3 4片叶，以同时期未经任何逆境处理的植株作为对照，同时取对照植株中叶柄、根材料，用于rna的提取以及cdna的合成。大肠杆菌菌株为本实验室保存；质粒载体pmd18-t、聚合酶

15、ex taq、dna回收试剂盒、dl2000 marker、反转录试剂盒、荧光定量染料sybr premix ex taq kit购自大连takara公司，总rna提取试剂盒购于天根生化科技有限公司（北京）。 7期 王广龙等：芹菜衔接蛋白基因agmu2的克隆与表达分析 1371 1.2 rna的提取及cdna的合成 采用总rna试剂盒（tiangen公司）提取总rna，利用反转录试剂盒（takara公司）将提取的总rna反转录成cdna。 1.3 芹菜agmu2基因的克隆 根据本实验室测定的六合黄心芹和美国西芹的转录组数据，以拟南芥（arabidopsis thaliana）ap-2复合体2亚

16、基氨基酸序列（登录号：np_199475）为检索起点，检索并拼接出芹菜衔接蛋白的2亚基基因agmu2序列，设计1对引物nxr53和nxr54，序列分别为5-atgccggtctctg cttccgctattta-3和5-ctagcaccttatctcataagaacctg-3。以六合黄心芹和美国西芹cdna为模板进行扩增。pcr反应程序为：94 预变性5 min；94 变性30 s，54 退火30 s，72 延伸1 min，共30个循环；72 延伸10 min。pcr产物用质量体积分数1.2%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，与pmd18-t载体连接过夜，并转化至大肠杆菌dh5中，提取质粒经pcr鉴

17、定后委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序。 1.4 序列分析 其他植物的mu2序列均来自于ncbi数据库，使用blast进行序列比对。先用软件dnaman对序列进行多重比对，然后构建同源进化树，并用mega5对进化树进行测试和编辑，生成报告图形（tamura et al.，2011）。使用http：/ 网站相关软件完成氨基酸序列理化性质分析（wilkinson & harrison，1991；gasteiger et al.，2003）。使用combet等（2000）的方法预测蛋白二级结构。采用dnaman软件进行蛋白质亲水性/疏水性分析（正值且数值高的氨基酸

18、具有更大的亲水性，而负值的氨基酸则更加疏水）。以老鼠ap复合体mu2（pdb id：2xa7_m）为模型，通过swiss-model（http：/）建立蛋白质空间结构模型（guex & peitsch，1997；schwede et al.，2003；arnold et al.，2006）。 1.5 实时定量pcr 荧光定量pcr采用abi 7300荧光定量pcr仪及其系统软件完成。用芹菜actin基因作为参考基因，与目标基因一起扩增，表达检测引物为actin-f：5-cttcctgccatatatgattgg-3和actin-r：5-gcc

19、agcacctcgatcttcatg-3。根据从美国西芹中扩增的agmu2序列设计表达检测引物bdagmu2f：5-gttgttgaggcagttgcattgttc-3和bdagmu2r：5-agg cttggacgagaatggtgaa-3。采用sybr premix ex taq试剂盒并按照操作说明进行实时定量pcr。以芹菜actin基因的转录表达水平作为内参，计算目的基因相对表达水平2-ct。其中 ct =（ct靶基因ct内参）处理组（ct靶基因ct内参）对照组。 2 结果与分析 2.1 芹菜agmu2基因的克隆 分别以2个芹菜品种的cdna为模板，以nxr53和nxr54为上、下游引物

20、，经pcr扩增后得到1 300 bp左右的片段。序列测定与分析表明，来源于美国西芹的agmu2基因含有1个1 317 bp的开放阅读框，编码438个氨基酸（图1），预测其蛋白质分子量为49.30 kd，等电点为9.28。来源于六合黄心芹的agmu2基因同样含有1个1 317 bp的开放阅读框，其与美国西芹的agmu2基因在核苷酸水平上有3个碱基的差异，分别是591位的t/a、599位的g/a和815位的c/t。编1372 园 艺 学 报 41卷 码的氨基酸有3个位点的差异，分别是197位的s/r、200位的r/h和272位的p/l。由于2个芹菜品种的agmu2基因具有高度同源性，以下以美国西芹

21、为例，对该基因编码的氨基酸序列进行序列比对、理化性质和空间结构等分析。 图1 芹菜agmu2基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列 * 表示终止密码子；阴影部分表示美国西芹和六合黄心芹agmu2基因差异位点，括号中位点来自六合黄心芹。 fig. 1 nucleotide acid and deduced amino acid sequences of agmu2 from celery * represents the stop codon；the shadows show the different sites of agmu2 betweenliuhe huangxinqinandmeigu

22、o xiqin. the sites in the brackets were fromliuhe huangxinqin. 2.2 芹菜agmu2的氨基酸序列与理化性质分析 将来自美国西芹的agmu2序列进行blast同源性比对，该亚基与拟南芥（arabidopsis thaliana）、荠菜（capsella juncea）、菜豆（phaseolus vulgaris）、大豆（glycine max）、鹰嘴豆（cicer arietinum）、蒺藜苜蓿（medicago truncatula）、水稻（oryza sativa）、玉米（zea mays）、高粱（sorghum vulgare

23、）、番茄（solanum lycopersicum）、马铃薯（solanum tuberosum）、黄瓜（cucumis sativus）、葡萄（vitis vinifera）和桃（prunus persica）的agmu2氨基酸序列相似度较高，同源性都达到了90%以上。其中葡萄和桃的氨基酸序列与本研究中克隆的agmu2同源性分别达到97.95%和97.49%，这说明agmu2基因在植物中的同源性较高。 对这些氨基酸序列进行多重比对，结果如图2所示，它们在保守区域均具有11（#所指氨基酸）7期 王广龙等：芹菜衔接蛋白基因agmu2的克隆与表达分析 1373 个相同的氨基酸残基，这些残基在磷酸化

24、等作用下形成两个疏水穴，使2亚基以氢键的方式与受体yxx结构结合（owen et al.，2004）。 图2 芹菜agmu2与其他物种agmu2氨基酸序列保守区域的多重比对 # 表示信号识别位点，箭头所示为其他活性位点。 fig. 2 alignment of conserved domains of agmu2 from celery and other plant species # represents signal recognition sites，the arrow marks other active binding sites. 1374 园 艺 学 报 41卷 对美国西芹和其

25、他植物的agmu2氨基酸序列进行理化性质分析（表1）。这些植物中的氨基酸残基数均为438个，相对分子质量为（49.2 49.4）× 103 kd。碱性氨基酸（包括赖氨酸，精氨酸和组氨酸）略多于酸性氨基酸（包括天冬氨酸和谷氨酸）。不同氨基酸序列各类理化性质相差不大，表明mu2基因在这些植物间具有高度同源性。 表1 不同植物来源的agmu2氨基酸组成成分及理化性质分析 table 1 the comparison of composition and physical and chemical characterization of amino acid sequences of agm

26、u2 from the different plant species 植物 plant species 氨基酸残基数 number of amino acid 理论相对分子 质量/kd theoretical relative molecular mass pi 碱性氨 基酸/% ratio of basic amino acid酸性氨 基酸/% ratio of acidic amino acid脂肪族 氨基酸/% ratio of aliphatic amino acid芳香族 氨基酸/% ratio of aromatic amino acid 蛋白质溶解性预测 （不溶蛋白）/% pr

27、ediction of protein solubility（ratio of insolubility） 美国西芹 apium graveolens 438 49 291.53 9.28 13.7 10.0 84.5 9.1 85.7 拟南芥 arabidopsis thaliana 438 49 322.49 9.27 13.9 10.3 84.7 8.9 86.7 荠菜 capsella juncea 438 49 336.52 9.27 13.9 10.3 84.7 8.9 86.7 菜豆 phaseolus vulgaris 438 49 278.33 9.33 13.7 10.0

28、84.7 9.1 86.2 大豆 glycine max 438 49 320.47 9.29 13.7 10.0 84.7 9.1 85.7 鹰嘴豆 cicer arietinum 438 49 240.54 9.27 13.7 10.0 84.7 9.1 83.1 蒺藜苜蓿 medicago truncatula 438 49 284.59 9.27 13.7 10.0 84.7 9.1 83.7 水稻 oryza sativa 438 49 270.52 9.32 13.7 10.0 84.9 8.9 86.2 玉米 zea mays 438 49 252.48 9.32 13.7 10

29、.0 84.9 8.9 86.2 高粱 sorghum vulgare 438 49 238.46 9.32 13.7 10.0 84.9 8.9 86.2 番茄 solanum lycopersicum 438 49 311.57 9.31 13.7 10.0 84.5 9.1 86.1 马铃薯 solanum tuberosum 438 49 283.52 9.31 13.7 10.0 84.5 9.1 86.2 黄瓜 cucumis sativus 438 49 362.60 9.24 13.7 10.0 84.0 9.1 86.4 葡萄 vitis vinifera 438 49 32

30、9.63 9.28 13.7 10.0 84.5 9.1 85.2 桃 prunus persica 438 49 392.69 9.28 13.7 10.0 84.5 9.1 84.7 2.3 美国西芹agmu2预测的氨基酸疏水性/亲水性 对本试验中克隆的美国西芹agmu2基因推导的氨基酸序列进行了疏水性/亲水性分析。结果（图3）表明，该亚基的第103位天冬氨酸亲水性最强，其次亲水性强的位点分别为第238位的精氨酸和第233位的谷氨酰胺；疏水性最强的位点为第70位的异亮氨酸，其次为第68位和第69位的异亮氨酸和缬氨酸，并且二者疏水性相同。 图3 美国西芹agmu2氨基酸序列的亲水性和疏水性

31、fig. 3 predicted hydrophilicity and hydrophobicity of deduced amino acid sequence of agmu2 frommeiguo xiqin 7期 王广龙等：芹菜衔接蛋白基因agmu2的克隆与表达分析 1375 2.4 芹菜agmu2的进化树分析 选取在氨基酸序列比对中相似度较高的14种植物，分析从美国西芹中分离的agmu2亚基与其他物种中相关亚基的进化关系，构建同源进化树。图4中美国西芹agmu2亚基与葡萄进化最近，豆科中的蒺藜苜蓿、鹰嘴豆、大豆、菜豆的mu2亚基属于同1个分支，十字花科中的荠菜和拟南芥中的mu2亚基同

32、属于1个分支，禾本科的水稻、玉米、高粱中的mu2亚基同属于1个分支。 图4 部分物种的mu2亚基氨基酸序列的系统进化树 fig. 4 phylogenetic tree of amino acid sequences of the mu2 subunit from several plant species 2.5 芹菜agmu2亚基二级结构和三级结构预测与分析 如图5所示，根据hierarchical neural network的分析，美国西芹agmu2亚基二级结构由37.44%的螺旋（alpha helix）、17.12%的延伸主链（extended strand）和45.43%的随机卷

33、曲（random coil）组成。整个agmu2亚基由5个螺旋和26条延伸主链组成，11个氨基酸残基组成的信号识别位点，可构成两个疏水穴，用来识别yxx结构。 图5 芹菜agmu2蛋白的三维结构 球棒结构为信号识别位点。 fig. 5 the three-dimension structure of agmu2 from celery the ball and stick structures represent signal binding sites. 1376 园 艺 学 报 41卷 图6 芹菜agmu2在不同组织中的表达水平 fig.6 expression analysis of a

34、gmu2 from celery in different tissues 2.6 agmu2在两个芹菜品种不同组织和不同逆境条件下的表达 目前关于agmu2功能的研究主要集中于该基因对花发育的影响。为了进一步分析和发掘agmu2基因的表达特性和功能，采用荧光定量pcr检测两个芹菜品种六合黄心芹和美国西芹agmu2基因在不同组织（根、叶柄和叶）以及不同逆境条件下的表达水平（图6，图7）。两个芹菜品种agmu2基因在根、叶柄、叶中均有表达，以叶中表达量最高（图6）。 逆境条件下的基因表达可以直接或间接反映基因功能的部分信息。如图7所示，随着不同逆境胁迫时间的延长，美国西芹中agmu2的表达趋向先

35、上升后下降的趋势。低温（4 ）以及盐害（20% nacl）条件下六合黄心芹中该基因表达趋势与美国西芹类似，但是在高温（38 ）和干旱（20% peg）条件下该基因表达一直升高（除高温8 h外）。高温胁迫下，六合黄心芹中该基因表达量在胁迫24 h时升至最高，而美国西芹中该基因响应较早，在胁迫1 h时就升至最高，且表达量升幅比六合黄心芹大，之后下降。低温条件下，六合黄心芹中该基因表达量在2 h时升至最高，美国西芹中在4 h时升至最高。干旱条件下两个芹菜品种的agmu2响应均较慢，美国西芹比六合黄心芹响应早且强度大，六合黄心芹中表达量均低于美国西芹。盐胁迫条件下，六合黄心芹中该基因表达在2 h，4

36、h时升至最高，美国西芹在8 h时升至最高，响应强度比六合黄心芹大得多。 图7 芹菜agmu2基因在不同逆境条件下的表达水平 同一品种竖条上方不同字母代表在0.05水平上的差异显著性。 fig. 7 expression analysis of agmu2 gene from celery under different adverse conditions different letters on the vertical bars indicate significant difference in the same cultivar at 0.05 level. 7期 王广龙等：芹菜衔接蛋

37、白基因agmu2的克隆与表达分析 1377 3 讨论 网格蛋白介导的内吞过程是植物自我调节的一个重要过程，同时它还在生长发育、激素传导、养分运输、抗毒以及抵抗病原等过程中行使重要功能（chen et al.，2011）。然而内吞过程需要多种蛋白和分子的参与，其中ap复合体在其中主要负责货物蛋白的分拣、网络蛋白和其他辅助蛋白的招募等（marsh & mcmahon，1999）。因此，研究衔接蛋白各亚基及其编码基因有利于揭示植物细胞内蛋白质合成、加工、转运等的确切途径，同时对于明确植物生长发育或响应环境变化的调控机制也有着重要的意义。 本研究中克隆的芹菜ap-2复合体的2亚基与葡萄、桃、黄

38、瓜、水稻等植物中预测的2亚基具有高度同源性，蛋白分子量均为49.20 49.40 kd，等电点9.20 9.40。其他理化性质也较类似，这说明2亚基在进化上相对保守。进化树分析进一步表明，芹菜2亚基与葡萄中的2亚基进化关系更为接近。2亚基属于mhd（mu homology domain）类蛋白，mhd是一类由大约280个氨基酸组成的功能域，其三维结构大部分是由折叠构成，而且以酪氨酸为基础信号的yxx结构是通过两条平行的折叠链组成的信号域得到识别（owen & evans，1998），这与本研究的结果类似。还有研究认为mhd能与突触蛋白相互作用，这些结果都说明了该结构功能的多样性（wal

39、ther et al.，2001）。 kim等（2013）认为ap2a1和ap2m是拟南芥ap-2复合体的一部分，ap-2介导的内吞过程对拟南芥花粉发育以及花粉管和雄蕊花丝的生长有着至关重要的作用，沉默复合体中的亚基基因apm2会使花粉败育或者花粉活力降低，而且会阻碍花粉管和雄蕊花丝伸长。而本研究中的芹菜ap-2复合体亚基与拟南芥亚基同源性达到了97.08%，预测2亚基及其ap-2复合体在芹菜中可能也有着类似的作用，具体调节机制需要进一步深入研究。荧光定量pcr结果显示，agmu2基因在不同组织中均可以表达，且在叶中表达量最高，表明该基因具有明显的组织特异性。植物生长素是调控植物生长发育和调控

40、逆境响应的重要激素之一。该基因能够响应高温、低温、干旱和盐等逆境信号，可能是因为内吞过程对生长素运输载体pin蛋白的影响导致的（dhonukshe et al.，2007），也有可能是agmu2基因通过与其他蛋白或者分子接触，共同应对环境刺激。从图7中还可以看出，干旱和盐胁迫条件下，该基因响应迟缓，可能是因为根部最先接触环境刺激，而这种胁迫或刺激传达到叶部需要一定的时间。同时两个芹菜品种对不同逆境胁迫响应的时间和强度均有差异，表明该基因可能在抗逆能力方面存在品种特异性。 本研究中克隆的agmu2基因对于研究芹菜生长发育、细胞信号传导、逆境响应、病原抵抗等过程有着较为重要的意义，同时也可为揭示芹

41、菜或者其他植物中蛋白合成、加工和转运等确切途径提供一定的理论支撑。 references arnold k，bordoli l，kopp j，schwede t. 2006. the swiss-model workspace：a web-based environment for protein structure homology modeling. bioinformatics，22：195201. bashline l，li s，anderson c t，lei l，gu y. 2013. the endocytosis of cellulose synthase in arabido

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