微生物第六七章总结

1、微生物的生长和控制第一节：测定生长繁殖的方法一.测生长量(一)直接法：有粗放的测体积法和精确的称干重法。(二)间接法：1. 比浊法2. 生理指标法二.计繁殖数(一)直接法：指用计数板(例如血球计数板)在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。此法十分常用,但得到的数目是包括死细胞在内的总菌数。可以采用特殊的染色法计算活细胞。(二)间接法：1. 平板菌落计数法：可用浇注平板或涂布平板或滚管法等方法进行。2. 厌氧菌的菌落计数法：亨盖特滚管培养法。第二节 微生物的生长规律一.单细胞微生物的典型生长曲线它只适合单细胞微生物如细菌和酵母菌,非典型的丝状菌生长曲线缺乏指数生长期, 与此期相当的只是培养

2、时间与菌丝体干重的立方根成直线关系的一段快速生长时期。根据微生物的生长速率常数, 即每小时分裂次数(的不同, 一般可把典型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等4个时期。(一)延滞期：延滞期又称停滞期、调整期或适应期。影响延滞期长短的因素：菌种类型，接种龄，接种量，培养基成分。(二)指数期：指数期又称对数期在指数期中,有 3 个重要参数,其相互关系及计算方法在书P155影响对数期的因素：菌种，营养成分，营养物质浓度，培养温度(三)稳定期：细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物; 芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢;在这时开始以初生代谢物作前体,合成抗生素等对人类有用的各种次生代谢物。稳

3、定期到来的原因是:营养物尤其是生长限制因子的耗尽;营养物的比例失调;有害代谢产物的累积;物理化学条件越来越不适宜等等。(四)衰亡期：有的微生物在这期会进一步合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢物;而在芽孢杆菌中, 往往在此期释放芽孢;等等。第三节 影响微生物生长的主要因素其中最主要的温度、pH和氧气。一.温度：生长温度三基点:最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度。在不同温度下，微生物的代谢产物可能会发生改变。二.PH：除不同种类微生物有其最适生长PH外, 即使同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理、生化过程, 也有不同的最适PH要求。三.氧气：按照微生物与氧的关系,可把它们粗分成好氧

4、微生物和厌氧微生物两大类。细分为专性好氧菌，兼性厌氧菌，微好氧菌，耐氧菌和厌氧菌。关于厌氧菌不能存活于氧气环境中的解释，现在普遍认为是因为厌氧菌中不存在过氧化氢酶和SOD（超氧化物歧化酶）第四节 微生物培养法概论一.实验室培养法(一)固体培养法1.好氧菌的固体培养：主要用试管斜面、培养皿琼脂平板。2.厌氧菌的固体培养：高层琼脂柱，厌氧培养皿，亨盖特滚管技术(二)液体培养法1. 好氧菌的液体培养：(1)试管液体培养; (2)三角瓶浅层液体培养; (3)摇瓶培养第五节 有害微生物的控制灭菌:采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措 施,称为灭菌.消毒: 是一种采用较

5、温和的理化因素,仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌, 而对被消毒的对象基本无害的措施。防腐: 防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖, 即通过制菌作用防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施。例如：低温，缺氧，干燥，高渗，高酸，高醇，防腐剂。一.物理灭菌因素的代表高温1.干热灭菌法把金属器械或洗净的玻璃器皿放入电热烘箱内, 在150170下维持12 h后, 可达到彻底灭菌(包括细菌的芽孢)的目的。2.湿热灭菌法(1)常压法巴氏消毒法：此法可杀灭物料中的无芽孢病原菌(如牛奶中的结核分枝杆菌或沙门氏 菌) , 又不影响其原有风味。具体方法可分两类: 第一类是经典的低

6、温维持法(LTH) ,例如用于牛奶消毒只要在63下维持30 min即可; 第二类是较现代的高温瞬时法（HTST）,用此法作牛奶消毒时只要在72下保持15 s。间歇灭菌法：适用于不耐热培养基的灭菌，将待灭菌的培养基放在80100下蒸煮 1560min,以杀灭其中所有的微生物营养体, 然后放至室温或 37下保温过夜, 诱使其中残存的芽孢发芽,第二天再以同法蒸煮和保温过夜, 如此连续重复 3 天即可在较低的灭菌温度下同样达到彻底灭菌的良好效果。(2)加压法常规加压蒸气灭菌法：一般称作“高压蒸气灭菌法”，一般要求为121，时间维持15-20min连续加压蒸气灭菌法:在发酵行业里也称“连消法”。此法仅用

7、于大型发酵厂的大批培养基灭菌。利用温度杀菌时几个关键的数值：D值是指在一定的致死温度下，90的活菌被杀死所需的时间（min ),即为D值。Z值是指如果在加热致时间曲线中，加热时间缩短90，所需升高的温度，这所需升高的温度即为z值，或者说杀菌时间变化10倍，相应的温度变化值。影响加压蒸气灭菌效果的因素：1. 灭菌物体含菌量 2. 灭菌锅内空气排除程度3. 灭菌对象的 pH4. 灭菌对象的体积5. 加热与散热速度 微生物的遗传变异和育种第一节 遗传变异的物质基础4 个基本概念:(1)遗传型：又称基因型, 指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因的总和。(2)表型：指某一生物体所具有的一切外表特征和

8、内在特性的总和,是其遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体体现。(3)变异：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改 变,亦即遗传型的改变。(4)饰变：即一种不涉及遗传 物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。一.三个证明遗传物质是核酸的经典实验：(一)经典转化实验：肺炎双球菌的转化实验(二)噬菌体感染实验(三)植物病毒的重建实验二.原核生物的质粒简介：(1)F质粒：又称F因子、致育因子或性因子,是E .coli等细菌决定性别并有转移能力的质粒。(2)R质粒：又称R因子，为细菌提供抗药性。(3)Col质粒：编码细菌素的质粒。(4)Ti质粒：即诱癌质粒或

9、冠瘿质粒。Ri质粒与Ti质粒类似。(5)mega质粒：即巨大质粒,存在于根瘤菌属中, 其上有一系列与共生固氮相关的基因。(6)降解性质粒：只在 Pseudomonas(假单胞菌属)中发现。这类质粒可为降解一系列 复杂有机物的酶编码,从而使这类细菌在污水处理、环境保护等方面发挥特有的作用。(7)2m质粒存在于酵母菌细胞中。第二节 基因突变和诱变育种一.基因突变（一）突变类型1. 营养缺陷型：某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力,因而无法再在基本培养基(MM)上正常生长繁殖的变异类型。2. 抗性突变型：指野生型菌株因发生基因突变,而产生的对某化学药物或致死物

10、理因子的抗性变异类型。6. 产量突变型：通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株, 称产量突变型。产量高则为正变株，产量低则为负变株。（二）基因突变的特点 自发性不对应性稀有性可诱变性稳定性可逆性（三）基因突变的机制1.诱发突变：诱发突变简称诱变,是指通过人为的方法, 利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变 频率的手段。凡具有诱变效应的任何因素, 都称诱变剂。(1)碱基的置换：因它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。置换又可分两个亚类: 一类称转换,即DNA链中一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换;另一类称颠换,即一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个

11、嘌呤所置换。直接引起置换的诱变剂: 例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂等间接引起置换的诱变剂: 5-溴尿嘧啶等(2)移码突变：指诱变剂会使 DNA 序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添(插入)或缺失,从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变。能引起移码突变的因素是一些吖啶类染料。(3)染色体畸变：包括染色体结构上的缺失、重复、插入、易位和倒位,也包括染色体数目的变化。某些强烈理化因子, 如电离辐射(X射线等)和烷化剂、亚硝酸等会导致染色体畸变。2. 自发突变：指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。（四）紫外线对 DNA 的损伤及其修复嘧啶对UV的敏感性比嘌呤强得多, 其光化学反应产物主要

12、是嘧啶二聚体(TT, TC, CC)和水合物,相邻嘧啶形成二聚体后, 造成局部DNA分子无法配对。二.突变与育种(一)自发突变与育种1. 从生产中育种2. 定向培育优良菌株(二)诱变育种1.诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群, 在促进其突变率显著提高的基础上,采用简便、快速和高效的筛选方法, 从中挑选出少数符合目的的突变株,以供科学实验或生产实践使用。2.艾姆斯试验艾姆氏试验是一种利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中是否存在化学致癌剂的简便有效方法。（三致作用：致癌致畸致突变）实验菌种：鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型试验方法：是在含待测可疑“三致” 物的

13、试样中,加入鼠肝匀浆液, 经一段时间保温后,吸入滤纸片中, 然后将滤纸片放置于上述平板中央。经培养后,出现结果。有三种结果在平板上无大量菌落产生, 说明试样中不含诱变剂;在纸片周围有一抑制圈, 其外周出现大量菌落, 说明试样中有某种高浓度的诱变剂存在; 在纸片周围长有大量菌落, 说明试样中有浓度适当的诱变剂存在。加入鼠肝匀浆的作用：因许多化学物质原先并非诱变剂或致癌剂,只有在进入机体并在肝脏的解毒过程中, 受到肝细胞中一些加氧酶的作用,才形成有害的环氧化物或其他激活态化合物, 故试验中先要加入鼠肝匀浆液保温;3. 营养缺陷型突变株的筛选方法与筛选营养缺陷型突变株有关的 3 类培养基:基本培养基

14、(MM,符号为 - ):仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需要的最低成分的组合培养基,称基本培养基。完全培养基(CM,符号为 + ):凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基, 称完全培养基。补充培养基(SM,符号为 A或B等):凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基, 称补充培养基。与营养缺陷型突变有关的 3 类遗传型个体:野生型:指从自然界分离到的任何微生物在其发生人为营养缺陷突变前的原始菌株。营养缺陷型:野生型菌株经诱变剂处理后, 由于发生了丧失某酶合成能力的突变,因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长, 这类突变菌株称为营养缺陷型突变株。原养型

15、:一般指营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株,其营养要求在表型上与野生型相同。(3)营养缺陷型的筛选方法诱变剂处理淘汰野生型：通过抗生素法或者菌丝过滤法即可检出缺陷型：夹层培养法: 先在培养皿底部倒一薄层不含菌的基本培养基（MM）,待凝,添加一层混有经诱变剂处理菌液的基本培养基（含菌MM）,其上再浇一薄层不含菌的基本培养基（MM）,遂成“三明治”状。经培养后,对首次出现的菌落用记号笔一一标在皿底。然后, 再向皿内倒上一薄层第四层培养基完全培养基（CM）。再经培养后,全长出形态较小的新菌落, 它们多数都是营养缺陷型突变株。限量补充培养法逐个检出法影印平板法鉴定缺陷型:可借生长谱法进行。第

16、三节 基因重组与杂交育种真核微生物中的有性杂交、准性杂交、原生质体融合以及原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等。一.原核生物的基因重组特点为: 片段性,仅一小段DNA序列参与重组;单向性,即从供体菌向受体菌(或从供体基因组向受体基因组)作单方向转移;转移机制独特而多样, 如接合、转化和转导等。(一)转化1.定义：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象,称为转化或转化作用。通过转化方式而形成的杂种后代,称转化子。2.感受态：凡能发生转化, 其受体细胞必须处于感受态。感受态是指受体细胞最易接受外源 DNA 片段并能实现转化的一种生理状态。(二)转导1.定义：通过缺陷噬

17、菌体的媒介,把供体细胞的小片段 DNA 携带到受体细胞中,通过交换与整合, 使后者获得前者部分遗传性状的现象, 称为转导。2.普遍转导：通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行“误包” , 而将其遗传性状传递给受体菌的现象,称为普遍转导。3.局限转导：指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中, 并与后者 的基因组整合、重组, 形成转导子的现象。(三)接合1. 定义：供体菌 (“雄性”) 通过性菌毛与受体 菌(“雌性”)直接接触, 把 F 质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者, 使后者获得若干新遗传性状的现象, 称为接合。2. E .coli的

18、4种接合型菌株根据F质粒在细胞内的存在方式, 可 把 E .coli 分成 4 种不同接合型菌株(1) F+ 菌株 即“雄性”菌株, 指细胞 内存在一至几个F质粒, 并在细胞表面着 生一至几条性菌毛的菌株。(2)F-菌株 即“雌性”菌株, 指细胞中无 F 质粒、细胞表面也无性菌毛的菌株。它可 通过与F+菌株或F菌株的接合而接受供体菌的F质粒或F质粒, 从而使自己转变成“雄性”菌株; 也可通过接合接受来自Hfr菌株的一部分或一整套核基因组 DNA(3)Hfr 菌株: 在Hfr菌株细胞中, 因F质粒已从游离态转变成在核染色体组特定位点上的整合态, 故Hfr菌株与F -菌株相接合后, 发生基因重组的

19、频率要比单纯用F+与F-接合后的频率高出数百倍。二.真核微生物的基因重组(一)有性杂交有性杂交, 一般指不同遗传型的 两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组,进而产生新遗传型后代的一种育种技术。(二)准性杂交1.定义：准性生殖是一种类似于有性生殖,但比它更为原始的两性生殖方式, 这是一种在同种而不同菌株的体细胞间发生的融合,它可不借减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。2.准性生殖过程(1)菌丝联结：它发生于一些形态上没有区别、但在遗传型上却有差别的同种不同菌株的体细胞(单倍体)间。发生菌丝联结的频率是极低的。 (2)形成异核体：两个遗传型有差异的体细胞经菌丝联结后,先发生质配,使两个

20、单倍体核集中到同一细胞中, 于是形成了双相的异核体。异核体能独立生活。 (3)核融合：或称核配, 指在异核体中的两个细胞核在某 种条件下,低频率地产生双倍体杂合子核的现象。(4)体细胞交换和单倍体化：体细胞交换，即体细胞中染色体间的交换,也称有丝分裂交换。3.准性杂交育种(1)选择亲本：即选择来自不同菌株的合适的营养缺陷型作为准性杂交的亲本。(2)强制异合：即用人为的方法强制两个营养缺陷型的亲本菌株形成互补的异核体。(3)移单菌落：将平板上长出的单菌落移种到基本培养基-的斜面上。(4)验稳定性：指设法检验获得的菌株究竟是一种不稳定的异核体,还是稳定的杂合二倍体。(5)促进变异：把上述稳定菌株所

21、产生的分生孢子处理,以促使其发生染色体交换、染色体在子细胞中分配不均、染色体缺失或畸变以及发生点突变等变化,从而使分离后的杂交子代(单倍体杂合子)进一步增加新性状变异的可能性。第四节 菌种的衰退、复壮和保藏一.菌种的衰退与复壮衰退：是指由于自发突变的结果, 而使某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。具体表现有: 原有形态性状变得不典型了生长速度变慢,产生的孢子变少代谢产物生产能力下降,即出现负变致病菌对宿主侵染力的下降,对外界不良条件包括低温、高温或噬菌体侵染等抵抗能力的下降等等。 狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下, 通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等

22、指标,从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体, 以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。广义的复壮则应是一项积极的措施, 即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前,就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作, 以期从中选择到自发的正变个体。(一)衰退的防止1.控制传代次数2.创造良好的培养条件3.利用不易衰退的细胞传代4.采用有效的菌种保藏方法(二)菌种的复壮1.纯种分离法2.通过宿主体复壮3.淘汰已衰退的个体二.菌种的保藏1.定义：通过适当的方法使得微生物能够长期存活，并保持原种的微生物学性状稳定不变的一类措施。2.原理：首先应挑选典型菌种或典型培养物的优良纯种, 最好保藏它们的分生孢子、芽

23、孢等体眠体;其次,还要创造一个有利于它们长期休眠的良好环境条件。3.七种常用的方法：冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封保藏法甘油悬液保藏法砂土保藏法冷冻干燥保藏法：干燥，低温，无氧，有保护剂液氮超低温保藏法：超低温（-196）各大菌种保藏单位普遍使用冷冻干燥保藏法和液氮超低温保藏法微生物的生态1.土壤中微生物的数目：尽管土壤的类型众多, 其中各种微生物的含量变化很大, 但一般来说, 在每克耕作层土壤中,各种微生物含量之比大体有一个 10 倍系列的递减规律:细菌(108 ) > 放线菌(107 , 孢子) > 霉菌(106 , 孢子) > 酵母菌 (105 ) &g

24、t; 藻类 (104 ) > 原生动物(103)2.微生物与生物环境间的关系：互生：两种可单独生活的生物, 当它们在一起时, 通过各自的代谢活动而有利于对方, 或偏利于一方的生活方式,称为互生。共生：是指两种生物共居在一起, 相互分工合作、相依为命, 甚至达到难分难解、合二为一的极其紧密的一种相互关系。寄生：一般指一种小型生物生活在另一种较大型生物的体内(包括细胞内)或体表, 从中夺取营养并进行生长繁殖,同时使后者蒙受损害甚至被杀死的一种相互关系。前者称为寄生物,后者则称作宿主或寄主。拮抗：指由某种生物所产生的特定代谢产物可抑制他种生物的生长发育甚至杀死它们的一种相互关系。捕食：一般指一

25、种大型的生物直接捕捉、吞食另一种小型生物以满足其营养需要的相互关系。习题：一.填空题1.证明核酸是遗传物质基础的是三个经典实验分别是：_、_和_。2.细菌的质粒种类很多，其中接合性质粒如_，抗药性质粒如_，产细菌素质粒如_，诱癌质粒如_等。3.常见的“三致”是指_、_和_，目前检出某试样是否含有三致作用的减简便。高效的试验是_。4.与营养缺陷突变有关的三类培养基是_、_和_。其符号分别是_，_和_。5.检出营养缺陷型一般有四种方法：_，_，_和_。6.艾姆斯试验中用的菌株是_的_缺陷型菌株，通过_突变可以测定待测样品中“三致”物质的存在。7.普遍转导与局限转导的区别在于：普遍转导噬菌体是_噬菌

26、体，而局限转导噬菌体是_噬菌体。普遍转导噬菌体能够转移供体菌的_基因，而局限转导噬菌体只能转移供体菌的_基因。8.在大肠杆菌接合过程中，有四种独特的菌株参与，他们是_、_、_和_。9.目前国际上代表性菌种保藏机构如美国的ATCC仅使用两种保藏方法，即_和_。二.判断题1.原养型是野生型的别称，两者不仅表型相同，而且遗传型也一致。2.受体细胞实现DNA转化，必须先出现感受态。3.5-尿溴吡啶是以碱基是以碱基颠换的方式引起基因突变的。4.微生物菌种退化的问题在工业生产中有时会遇到，一旦菌种退化，生产效率下降，更重要的是：退化菌种群体中再也找不到生产能力正常的细胞。5.准性杂交中能够导致低频率的基因

27、重组是因为这些真菌的杂合二倍体细胞在进行减数分裂时，同源染色体进行配对而发生染色体之间交换的结果。6.在筛选营养缺陷型时，在完全培养基中加入青霉素，可以有效杀死大量生长繁殖的野生型菌株，从而达到浓缩营养缺陷型的作用。7.普遍转导可将供体菌的任何基因转导，故可使受体菌成为获得全套供体菌基因组的转导子。8.转化和转导都不需要供体菌和受体菌的完整细胞直接接触而进行的。9、当大肠杆菌的F+和F-菌株发生结合时，F因子由供体菌进入受体菌，从而使原F+变成了F-，而原F-变成了F+。10.粘质沙雷氏菌在25下形成血红色菌落，但置于37下则形成无色菌落，这说明该菌种发生了衰退。11.C+G%值差别越远的两种生物，其亲缘关系必然十分疏远。12.亲缘关系越近的微生物，其碱基序列也越接近，故核酸分子杂交的同源性百分值就越高。13.微生物的