柿采后丙烯和1甲基环丙烯处理对两个扩展蛋白基因表达的影响

1、园 艺 学 报 2014，41（6）：10891095 http: / www. ahs. ac. cn acta horticulturae sinica e-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140210；修回日期：20140410 基金项目：国家自然科学基金项目（30771756）；农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目 * 通信作者 author for correspondence（e-mail：dqr0723） 柿采后丙烯和1甲基环丙烯处理对两个扩展蛋白基因表达的影响 孙振营，韩 叶，李秀芳，马秋诗，饶景萍* （西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 7

2、12100） 摘 要：为进一步了解扩展蛋白（expansin，exp）在柿果实采后软化过程中的作用，以丙烯和1甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-mcp）处理富平尖柿采后果实，采用实时荧光定量pcr技术检测果实中exp基因表达量的变化。结果显示，丙烯促进柿果实成熟软化，使乙烯释放高峰升高并提前到来，提高acc合成酶（acs）、acc氧化酶（aco）活性；1-mcp减缓柿果实的成熟软化，推迟并降低乙烯释放高峰，抑制acs和aco活性。随着贮藏时间的延长，柿果实逐渐软化，对照果实dkexp3和dkexp4的相对表达量均表现为先上升后下降的趋势。丙烯处理促进了dkexp3和dk

3、exp4的表达，使表达高峰升高且提早到来；1-mcp处理抑制了dkexp3和dkexp4的表达，推迟且降低了表达高峰。对照和1-mcp处理的果实的dkexp3和dkexp4的相对表达量高峰均较乙烯释放高峰早。dkexp3和dkexp4在果皮、果肉、果心中表达水平不同。本结果说明exp可能在采后柿果实成熟软化前期起作用，其表达有组织特异性，且受到乙烯的调控。 关键词：柿；丙烯；1甲基环丙烯；exp；实时荧光定量pcr 中图分类号：s 665.2 文献标志码：a 文章编号：0513-353x（2014）06-1089-07 effects of propylene and 1-methylcycl

4、opropene on expression of two exp genes in persimmon fruits sun zhen-ying，han ye，li xiu-fang，ma qiu-shi，and rao jing-ping* （college of horticulture，northwest a & f university，yangling，shaanxi 712100，china） abstract：in order to further explore the function of expansins（exp）in the postharvest soft

5、ening progress of persimmon fruits，fuping jianshiwas treated with 1-mcp and propylene，respectively. real- time fluorescent quantitative pcr technology was used to detect the relative expression level of exp genes in persimmon fruits. the results showed that propylene treatment promoted the softening

6、 of persimmon fruits，increased ethylene production and advanced the onset of climactic of ethylene production and accelerated the enzymatic activity of acs and aco. however，1-mcp treatment delayed the softening of persimmon fruits，retarded and reduced the peak of ethylene production，inhibited the en

7、zymatic activity of acs and aco. accompanying with fruit ripening，the expression levels of dkexp3 and dkexp4 in control fruit increased sharply to maximum within the first 9 d of storage，followed by a 1090 园 艺 学 报 41卷 steady decline until the end of storage. treatment with propylene promoted the exp

8、ression of dkexp3 and dkexp4，increased and advanced the peak of their expression；treatment with 1-mcp showed a suppression of dkexp3 and dkexp4 expression in persimmon fruit，delayed and reduced the peak intensity. the peak expression levels of dkexp3 and dkexp4 in control fruits and 1-mcp treatment

9、fruits appeared earlier than those of the peak of ethylene production rate. the expression levels of exp genes were different in sarcocarp，pericarp and core. the results indicated that exp might play a role in the early stage of postharvest persimmon fruit ripening and softening progress. the expres

10、sion of exp genes is tissue-specific and regulated by ethylene. key words：persimmon；propylene；1-mcp；exp；real-time quantitative pcr 柿果实采后极易软化，严重制约其贮藏保鲜和市场流通，使之不能充分发挥应有的经济价值（付润山 等，2010）。果实的软化是由于其细胞壁结构和组成成分发生了变化（brummell & harpster，2001；brummell，2006；bennett & labavitc，2008）。exp（expansin，扩展蛋白）是

11、一类细胞壁蛋白，可以调节细胞壁的松弛和伸展。近年来研究表明exp几乎参与了植物生长发育的各个阶段，在果实的成熟软化上也起到重要的作用。目前已在番茄（rose et al.，1997）、猕猴桃（杨绍兰 等，2007）、枇杷（yang et al.，2008）等果实中证明exp与果实的成熟软化相关。为了更全面了解柿果实采后软化的机制，对exp的研究不可或缺。本课题组已对柿果实exp进行了克隆分析及原核表达测定，获得了7个exp的基因序列（童斌 等，2005a；常晓晓 等，2010）。 本研究中以中国涩柿优良品种富平尖柿（diospyros kaki l.fuping jianshi）为材料，利用乙

12、烯类似物丙烯（丙烯作用效应约为乙烯的1%，代替乙烯处理果实，消除对内源乙烯的干扰）和乙烯作用抑制剂1-mcp处理，研究exp在柿果实采后成熟软化过程中的表达特点及作用，为研究柿果实的成熟软化机制提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料及处理 富平尖柿果实于八成熟时（2012年10月12日）采自陕西省富平县。采收当天运回实验室，选取成熟度一致、大小均一、无病虫害、无机械损伤的果实作为试材。将果实随机分成3组，一组密闭于含丙烯5 000 µl · l-1的容器中24 h，一组密闭于含1 µl · l-1 1-mcp的容器中24 h，另一组密闭于空白容

13、器中24 h作为对照。每个处理3个重复，每个重复20 kg果实。处理后通风0.5 h，立即放入瓦楞纸箱，置于常温中贮存。每3 d取样1次，进行相关指标测定。果实去皮后，果肉（不含果心部分）被迅速切成0.5 1 cm3的小块用液氮速冻，置于80 超低温冰箱保存，用于酶活性的测定及柿果实总rna的提取。另取刚采收未经任何处理的富平尖柿果实，按果皮、果肉（中果皮，环绕种子外沿与果皮之间的部分）、果心（环绕种子外沿以内部分，除种子以外）分别取样并提取总rna，用于不同组织中dkexp3和dkexp4的相对表达量分析。 1.2 生理指标测定 果肉硬度采用gy-1型硬度测定仪测定，每次随机取9个果在胴部去

14、皮测定，当果实硬度下降到 2 kg · cm-2停止取样。乙烯释放速率参照付润山等（2010）的方法，使用trace gc uitra型气相色谱仪法测定：载气为n2，gdx-502色谱柱，柱长2 m，柱温70 ，进样口温度70 ，氢气6期 孙振营等：柿采后丙烯和1甲基环丙烯处理对两个扩展蛋白基因表达的影响 1091 0.7 kg · cm-2，空气0.7 kg · cm-2，氮气1.0 kg · cm-2，进样量1 ml，氢火焰离子化检测器检测，检测室温度150 。acc合成酶（acs）和acc氧化酶（aco）活性的测定按照果蔬采后生理生化实验指导（曹建

15、康 等，2007）中的方法进行，单位为nmol · h-1 · g-1。 1.3 exp基因实时荧光定量分析 参照童斌等（2005a）的方法提取柿果实总rna，并参照祝庆刚等（2012）的方法检测提取的柿果实总rna并反转录。使用icycler iq5实时定量pcr仪器（bio-rad，美国）进行rt-qpcr检测。反应体系为20.0 µl，含有10.0 µl sybr premix ex taqtm（takara），1.0 µl cdna，7.4 µl ddh2o，上、下游引物各0.8 µl（引物浓度10 µmo

16、l · l-1）。运行程序为：95 预变性3 min，95 变性30 s，56 退火30 s，72 延伸30 s，40次循环。每个样品3次重复。 在已获得的7条exp基因中，以序列是否完整、同源性和获得基因的果实时期为条件进行筛选，最终选取了成熟期克隆得到的、已获得全长序列的dkexp3（即cdk-exp3）和转色期克隆得到的dkexp4（即cdk-exp4）（常晓晓 等，2010）为代表进行测定。 以柿actin（zhang et al.，2012）作为内参，设计内参引物。参照dkexp3（genbank登录号为：fj455264）和dkexp4（genbank登录号为：fj472

17、608）的碱基序列设计特异性引物，具体引物序列见表1。 表1 实时荧光定量pcr使用的引物 table 1 primers used in real time quantitative pcr 目标基因 target gene 引物名称 primer name 引物序列（53） sequences of primers（53） dk-actin dk-actin（for） dk-actin（rev） ggattctggtgatggtgttag cagcagttgttgtgaaggagt dkexp3 dkexp3（for） dkexp3（rev） tcactgccactaacttctgc tc

18、ttattccaccctttttcac dkexp4 dkexp4（for） dkexp4（rev） acccaaaattggcattgaga aatatcaaaggtgaccccaac 用上述特异性引物进行rt-pcr反应，获得pcr产物，与目标基因进行比对，保证pcr产物为目标基因上的片段。采用2-ct公式计算基因相对表达量（livak & schmittgen，2001），其中ct =（cttargetctactin）timex（cttargetctactin）time0。cttarget和ctactin分别是目标基因和内参基因的ct值；timex和time0分别指取样时间。相对

19、表达值的计算参照姜妮娜等（2010）的方法进行。 1.4 数据分析 试验数据采用excel软件进行统计分析，显著性差异使用lsd法，并使用origin 8.5软件进行分析制图。 2 结果与分析 2.1 丙烯和1-mcp处理对果实硬度的影响 硬度是反应果实贮藏品质的重要指标之一。图1，a显示，常温贮藏过程中各处理果实硬度均呈下降趋势。与对照相比，丙烯处理加速了果实硬度的下降，贮藏3 d即下降到6.65 kg · cm-2，仅为同期对照果实的59.64%，贮藏9 d即达到软化（硬度值 2 kg · cm-2）。1-mcp处理显著延缓了果实硬度下降，贮藏期间硬度始终高于对照，在贮

20、藏21 d时硬度下降为刚采收时的28.6%，显著高于同期对照果实的硬度（p < 0.05）；最终于贮藏27 d达到软化。 1092 园 艺 学 报 41卷 2.2 丙烯和1-mcp处理对柿果实乙烯释放速率的影响 乙烯释放速率是反应跃变型果实采后生理变化的重要指标。图1，b显示，丙烯处理的果实乙烯释放高峰提前，出现在贮藏3 d时（比对照提早9 d），其峰值极显著（p < 0.01）高于其他处理，是对照峰值的1.9倍，是1-mcp处理果实的2.2倍。1-mcp显著推迟果实乙烯高峰出现时间（贮藏18 d），且降低了乙烯高峰的峰值（为对照的87.73%）。 图1 丙烯和1-mcp处理对柿果

21、实硬度（a）和乙烯释放速率（b）的影响 fig. 1 effects of propylene and 1-mcp treatments on firmness（a）and ethylene release rate（b）of persimmon fruits 2.3 丙烯和1-mcp处理对柿果实acs和aco的影响 acs和aco是乙烯生成过程中的关键酶。图2显示，在贮藏过程中，对照果实的acs和aco的活性总体上表现为先上升后下降的趋势。对照果实的acs活性升高（9 d）早于aco（12 d），但是两者均在18 d后开始下降。丙烯处理促进了acs和aco的活性升高，两种酶均在贮藏3 d出现

22、高峰，随后迅速下降；1-mcp处理抑制了两种酶的活性，其活性始终低于对照果实。 图2 丙烯和1-mcp处理对柿果实acs（a）和aco（b）的影响 fig. 2 effects of propylene and 1-mcp treatments on acs（a）and aco（b）of persimmon fruits 2.4 丙烯和1-mcp处理对柿果实的dkexp3和dkexp4表达的影响 图3，a显示，对照果实dkexp3的相对表达量在贮藏的前9 d迅速上升，9 d时为表达高峰，随后缓慢下降。与对照相比，丙烯处理促进了dkexp3的表达，表达高峰出现在贮藏3 d时，较对照提前了6 d，

23、且峰值是对照峰值（9 d）的2.9倍；达到高峰后迅速下降，至贮藏结束时相对表达6期 孙振营等：柿采后丙烯和1甲基环丙烯处理对两个扩展蛋白基因表达的影响 1093 图4 富平尖柿果实dkexp3和dkexp4 在不同组织内的相对表达的水平 fig. 4 relative expression level of dkexp3 and dkexp4 in different tissues offuping jianshi p < 0.05. 量降至1.3。1-mcp处理抑制了dkexp3的表达，贮藏3 d表达量下降为贮藏0 d的73.9%，随后开始上升，但低于对照，至贮藏15 d达到表达高峰

24、，较对照推迟了6 d，峰值为对照峰值的79.2%；与对照相似，高峰出现后表达量下降速度较缓慢。 图3，b显示，dkexp4的相对表达量变化与dkexp3相似。但是丙烯处理的促进作用小于对dkexp3的，表达高峰为对照高峰的1.9倍。1-mcp处理对dkexp4表达量的影响与对dkexp3的相似。 从以上结果可见，对照果实和1-mcp处理的果实中dkexp3 和dkexp4的相对表达量高峰均较乙烯释放速率高峰早。 图3 丙烯和1-mcp处理下柿果实dkexp3（a）和dkexp4（b）表达的水平 fig. 3 expression level of dkexp3（a）and dkexp4（b）i

25、n persimmon fruits treated with propylene and 1-mcp 2.5 柿果实不同组织中dkexp3和dkexp4表达的差异 如图4所示。果心和果皮中dkexp3的相对表达量相近，均显著低于果肉（p < 0.05），dkexp4的相对表达量在果心中最高，果肉次之，在果皮中最低，三者差异显著（p < 0.05），表明柿果实中dkexp3和dkexp4的表达具有组织特异性。 3 讨论 作为一类细胞壁蛋白，exp几乎参与了植物体所有的生长发育过程（张娟 等，2011）。exp在果实成熟软化过程中发挥着特定的作用。自从rose等（1997）发现一个-

26、expansin基因leexp1在番茄后熟期特异性表达以来，先后利用反义技术（brummell et al.，1999）、northern杂交（杨绍兰 等，2007）、实时荧光定量（牛艳梅 等，2008；gaete-eastman et al.，2009）等技术手段对果实中的exp基因进行了研究，均表明exp部分成员与果实的成熟软化相关，且受乙烯的调控。目前1094 园 艺 学 报 41卷 尚没有化学方法能够测定exp的活性，利用实时荧光定量方法分析转录水平上exp的表达特点显得尤为必要。 本试验中，与对照果实相比，丙烯处理硬度下降迅速，乙烯高峰提早且升高，acs、aco活性受到促进；而1-m

27、cp处理果实，硬度下降减慢，延长了果实的贮藏期，乙烯高峰推迟且降低，acs、aco活性受到抑制。与对照相比，丙烯处理促进dkexp3和dkexp4的表达，相对表达量高峰提前了6 d，峰值有显著升高；1-mcp处理的高峰推迟，峰值显著低于对照，且总体水平有所降低。可见，dkexp3和dkexp4的表达受乙烯调控，在乙烯大量存在的情况下，其表达水平也迅速提高；而在乙烯合成受抑制时，其表达水平提高的速率也相对降低。在贮藏后期，随着内源乙烯的不断生成，乙烯受体蛋白逐渐消耗，果实对1-mcp敏感度减低（zhang et al.，2011）。本试验中，对照和1-mcp处理果实的dkexp3和dkexp4的

28、均较对应的乙烯高峰出现提前，这与杨绍兰等（2007）在猕猴桃上的研究成果相似。已有证据表明，尽管exp自身缺乏水解酶活性，但它却能提高纤维素酶对纤维素的水解活性。这种相互促进作用表明exp使微纤维表面的葡聚糖对纤维素酶的攻击更加敏感（童斌 等，2005b；金漫 等，2010）。这表明dkexp3和dkexp4与柿果实成熟软化有一定的关系，尤其是在乙烯跃变高峰来临之前的作用较重要。 本试验中，富平尖柿未处理果实的dkexp3和dkexp4相对表达量在果皮、果肉、果心中存在显著差异，表明exp存在组织特异性。贮藏过程中观察到果实各组织的软化先后顺序为果心最早，果肉次之，果皮最晚，这可能与扩展蛋白的

29、特异性表达有关，但仍需要结合其他水解酶活性变化特点的研究进一步证实。 通过以上分析，推测柿果实中与成熟有关的dkexp3和dkexp4主要在果实的成熟软化前期起作用；其表达有组织特异性，且受到乙烯的调控，但其信号传递路径尚不明确。要全面了解exp在柿果实成熟软化过程中的调控机制，特别是与其他细胞壁水解酶的相互作用以及对其他植物激素的反应如何，还需要更深入的研究。 references bennett a b，labavitc j m. 2008. ethylene and ripening-regulated expression and function of fruit cell wall

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