实验三、限制性内切酶切割DNA

1、实验三.限制性内切酶切割dna （4学时）实验目的1. 通过对dna的酶切，学会设计构建体外重组dna分子;2. 根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶；3. 掌握dna的酶切技术。实验原理限制性内切酶是从细菌屮分离出来的一种能在特异位点切割dna分子的核 酸内切酶，目前已从多种细菌屮分离出超过400种，识别各自不同的核营酸顺序, 这一顺序大多为具冇一对称屮心的回文序列，如从大肠杆菌中分离的ecori识 别:.gaattc.切割后产生.cttaag.g和 aattc.的末端，.cttaag.该末端由丁冇一段小的能互补配对的单链突出，故称为粘性末端。切割后的末端 为3，oh和亍磷酸基团。8p.g

2、-oh.cttaa-po冇的限制性酶识别四碱基对的顺序，如san3a识别gatc ；有的识别六ctag碱基对，如上述的ecor io识别四碱基对的内切酶由于识别顺序在dna出现的 频率更高（四碱基酶为44=256,六碱基酶为46=4096）,因而可将dna切割成 更小的片段，而识别八碱基对的no/i.gcggccgc.cgccggcg.则识别和切割位点更少（4* = 65536）,但碱基并不以均等的概 率出现，因而切割后产生的片段变化范围很大。限制性内切酶作用的温度一般为37°c,反应体系屮以mg2+为唯一的辅助因 子，冃要求ph缓冲在7.5左右。商品酶都保存在50%的tt油溶液屮，

3、20°c贮存，活性通常较高，5u/m1 （每 单位即最适条件下1小时内完全酶解1 |ig dna的酶量）。实验材料待酶切的dna样品实验仪器、器皿及试剂仪器：可调微量加样器、恒温水浴箱、电泳仪、电泳槽、紫外检测灯 器b1l： eppendorf管、tip、试管架试剂:lkb标准dna分子量bcmhi、k/i限制性内切酶 1 oxbuffer： 50mmol/l nacl10mmol/l tris-hcl(ph7.5)10mmol/l mgchlmmol/1 dtt (二硫苏糖醇)实验步骤1. 将dna样品lpg溶解在16口1重蒸水中（在灭菌的eppendorf管中进行）2. 加入2|

4、il 1 oxbuffer,酶解buffer由厂家提供。3. 加入12u的限制性内切酶b伽hi、kpnl （限制性酶很昂贵，从20°c取出耍 置于冰上，吸取要新的tip头，以免污染杂质，吸完后尽快放冋冰箱）。4. 混匀反应液后，稍离心使液体聚集，置37°c温育1小时。5. 终止反应加入0.5mol/l edtana2至终浓度为10mmol/lo6. 进行电泳检查酶切结果，100v0.51小时。7. 紫外灯下观察消化效果。注意事项1.分了生物学实验大多为微量操作，dna样品与限制性内切酶的用量都极 少，必须严格注意吸样量的准确性以保证酶切效果最佳。现介绍三种微量取样方 法：（

5、1）吸样时，将tip尖刚刚接触到液面时，轻轻吸取。此法可吸取0.2-0.5（11 的样品，注意不要将tip尖全部插入溶液，这样tip壁上会沾上很多的样品，导 致吸样不准。(2) 用lcm长的塑料毛细管代替tip吸样，此法也可吸取0.20.5pl的样量。(3) 目而也有细长tip出售，专门用于吸取微量样品。2限制性内切酶价格比较贵，因此要注意不使其污染而导致浪费。这就要 求每次吸酶时要用新的无菌tipo另一个造成限制性内切酶浪费的因素就是限制 性内切酶的失活。因此，要注意加样次序，即各项试剂加好后，最后才加酶，并 要在冰上操作，口操作要尽可能快，以使限制性内切酶拿出冰箱的时间尽可能短。若用同一酶消化很多样品时，可先计算出所需酶量(可稍多计一点)，取出 此量的酶与lx缓冲液混合，然后再分装至各个反应管内。这样可节约用酶且缩 短操作过程、减少污染机会。3. 开启eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防杂酶污染。4. 样品在37°c与65°c保温时，要注意将eppend