三种灵芝不同部位活性成分含量差异性研究

1、三种灵芝不同部位活性成分含量差异性研究摘要目的比较三种灵芝(霍芝1号、韩芝、日 芝)不同药用部位的总多糖、总三菇、灵芝酸a及灵芝酸b 的含量差异，为全面评价灵芝药材及砲子粉的质量及其药用 成分的合理利用提供依据。方法采用苯酚-硫酸法测定总 多糖含量；香草醛-冰乙酸-高氯酸显色法测定总三菇的含 量；hplc法测定灵芝酸a、b的含量。结果每种灵芝不同 药用部位的总多糖含量由高到低依次为：胞子粉菌盖菌 柄；每种灵芝不同药用部位的总三菇含量由高到低依次为： 菌盖菌柄鞄子粉；每种灵芝不同药用部位的灵芝酸a和灵 芝酸b含量由高到低依次为：菌盖菌柄鞄子粉，且灵芝酸 a的含量均明显高于灵芝酸bo结论该研究为全

2、面评价灵 芝子实体及鞄子粉的质量及其药用成分的合理利用提供依 据。关键词灵芝；药用部位；总多糖；总三菇；灵芝酸中图分类号r284. 1 文献标识码b 文章编号 2095-0616 (2013) 21-33-04灵芝(ganoderma lucidium)属担子菌门多孔菌科真菌 赤芝或紫芝的干燥子实体，是常用的滋补强壮、扶正固本中 药，在中国有着悠久的药用历史。多糖和三菇类化合物是灵 芝子实体及胞子粉的主要活性成分1。其中，灵芝多糖具 有提高机体免疫能力、抗肿瘤2、抗癌症、抗衰老、调节 血脂等药理活性，灵芝三菇类化合物具有抗肿瘤、抗hiv-1 型病毒、护肝、解毒和改善记忆等活性3-6 o从药学的

3、角 度来看，多糖和三菇类化合物含量的高低可以作为评价灵芝 药用价值和品质的重要依据。灵芝由菌盖、菌柄和砲子组成, 这3个部位在灵芝不同的生长阶段起着不同的功能作用，其 活性成分含量也必然存在一定的差异。因此，本研究对3种 灵芝不同药用部位的总多糖、总三菇及主要三菇酸类成分灵 芝酸a和灵芝酸b进行含量测定，为灵芝质量评价及开发利 用提供科学的依据。1材料、仪器及试剂霍芝1号、韩芝和日芝子实体及胞子粉采自安徽霍山县（位于北纬 31° 037 -31° 33，东经 115° 52 -116° 32 之间）灵芝种植基地，由安徽衡济堂灵芝产业开发有限公司 提供。将

4、霍芝1号、韩芝、日芝子实体用清水洗净后晾干， 将其分为菌盖和菌柄两部分与胞子粉于5（rc烘干，菌盖及菌 柄分别粉碎后备用。kq-250e型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； ab265-s/10万电子天平（梅特勒-托利公司）；tu-1900型紫 外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；美 国waters型高效液相色谱仪；标准品灵芝酸a,灵芝酸b（上 海同田生化技术有限公司提供，纯度均在98%以上）；齐墩果 酸及葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所）；乙睛（色 谱纯）；重蒸憎水；氯仿、硫酸甲酸、石油瞇、乙酸乙酯、 无水乙醇、无水甲醇等试剂均为分析纯。2方法2.1总多糖含量测定2

5、. 1. 1标准曲线制作精密称取在105t干燥至恒重的 葡萄糖对照品5mg,加水溶解并定容至50ml,即得浓度为 0. lmg/ml的对照品溶液。分别精密量取对照品溶液0.2,0. 3. 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1. oml 于 15ml 具塞试管中, 加水至2. oml,再加入lml 5%苯酚和5. oml浓硫酸，摇匀， 置于沸水中水浴20min,取出冰浴冷却lomin,以相应的试 剂为空白对照。在490nm处测定吸收度，以葡萄糖的质量（ug）为横坐标，以吸收度为纵坐标，得标准曲线 y=0. 0064x+0.0071, r2=0. 9991o2. 1.2供试品溶液制备

6、及含量测定 取样品粉末约2g, 精密称定，置索氏提取器中，加水90ml,电加热器加热回流 提取至提取液无色，提取液转移至looml容量瓶中，加水至 刻度，摇匀，精密量取10ml,加入乙醇150ml,摇匀，4°c 放置12h,取出，离心，倾去上清液，沉淀加水溶解，转移 至50ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液。 精密量取供试品溶液2ml,至15ml具塞试管中，按照标准曲 线的制备项下的方法，自“精密加入苯酚iml”起，依法测 定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含葡萄糖的重量 并计算含量。由表1可知，霍芝1号、韩芝及日芝的不同药用部位总 多糖含量高低均表现为：胞子粉菌盖菌

7、柄，其中鞄子粉中 总多糖含量明显高于菌盖和菌柄中总多糖含量。不同灵芝的 菌盖中总多糖含量高低依次是：霍芝1号韩芝日芝；不同 灵芝的菌柄中总多糖含量高低依次是:霍芝1号韩芝日芝; 不同灵芝的胞子粉中总多糖含量高低依次是：日芝霍芝1 号韩芝。见表lo2.2总三菇含量测定2. 2.1标准曲线制作精密称取齐墩果酸对照品 13. 65mg,置于50ml容量瓶中，加无水乙醇溶解定容至刻度, 得0. 273mg/ml齐墩果酸对照品溶液。精密吸取齐墩果酸对 照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0. 6ml 于 15ml 具塞试 管中，随行试剂做空白对照，沸水浴中挥干溶剂，加入新鲜 配制的5%香草

8、醛-冰醋酸溶液0. 4ml,高氯酸1. 6ml,迅速用 混合仪混匀溶液。然后将试管置于709水浴加热15min,拿 出冷却至室温。加入8ml乙酸乙酯并混匀溶液，于560nm处 测定吸光度。以齐墩果酸的质量（ug）为横坐标，吸光度 为纵坐标，得标准曲线 y=0. 0050x-0. 0257, r2=0. 9997o2. 2.2供试品溶液制备及三菇含量测定 精确称取霍芝 1号、韩芝、日芝菌盖、菌柄各3份，每份250mg,置于50ml 容量瓶中，加无水乙醇15ml；再精确称取霍芝1号、韩芝、 日芝鞄子粉，各3份，每份500mg置于50ml容量瓶中，加 无水乙醇30mlo超声提取30min,定容至50

9、ml,过滤即得供 试品溶液。精密吸取lml于15ml具塞试管中，按标准曲线 项下操作测吸光度值并计算总三菇含量并计算含量。结果见 表2o由表2可知，霍芝1号、韩芝及日芝的不同药用部位总 三菇含量高低均表现为：菌盖菌柄胞子粉，差异明显。不 同灵芝的菌盖中总多糖含量高低依次是：日芝霍芝1号韩 芝；不同灵芝的菌柄中总多糖含量髙低依次是：韩芝霍芝1 号日芝；不同灵芝的胞子粉中总多糖含量高低依次是：韩 芝霍芝1号日芝。2.3灵芝酸a和灵芝酸b含量的测定2. 3. 1 色谱条件 kromasil 100-5c18 色谱柱(250mmx 4.6mm, 5um)；流动相为乙惰-0. 1%甲酸溶液；采用梯度洗

10、脱，梯度洗脱条件；05min, 27%30%；乙睛：550min, 30%；乙睛：5060min, 30%35%；乙睛。柱温为25°c；流 速：0. 8ml/min；进样量10 p l；检测波长254nmo色谱图见 图lo2. 3.2供试品溶液制备精密称取菌盖及菌柄样品2g, 加入50ml三氯甲烷，超声处理30min,取出放冷，滤过，滤 液蒸干，残留物置loml量瓶中，以甲醇溶解，并加至刻度, 摇匀；精密称取菌盖及菌柄样品10g,加入250ml三氯甲烷, 超声处理30min,取出放冷，滤过，滤液蒸干，残留物置2ml 量瓶中，以甲醇溶解，并加至刻度，摇匀；以上溶液经0. 45 um 微

11、孔滤膜滤过，即得供试品溶液。2. 3. 3对照品溶液制备 精密称取适量灵芝酸a、灵芝酸 b对照品，分别置5ml量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，摇 匀，制成灵芝酸a、灵芝酸b对照品溶液，质量浓度分别为1. 036mg/ml和0. 964mg/ml的单一对照品储备液。精密吸取 灵芝酸a储备液100 p l和灵芝酸b对照品储备液500 u l, 用甲醇定容至5ml量瓶中，摇匀，制成灵芝酸a和灵芝酸b 的混合对照品溶液，质量浓度分别为0.207加g/ml和 0. 0964mg/mlo2. 3.4方法学考察2. 3. 4. 1线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液2、4、8、10、20、50 ul,注入

12、高效液相色谱仪中，按照上 述色谱条件测定各成分的峰面积。以进样质量（ug）为横 坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线，得 灵芝酸a和灵芝酸b的回归方程分别为：yje+06x-47907, r2=0. 9999, y=1e+o6x-27751, r2=l. 0000。灵芝酸 a 和灵芝 酸b分别在0. 4110. 36 u g和0. 1934. 82 u g范围内线性 关系良好。2. 3. 4. 2精密度试验 取灵芝酸a和灵芝酸b混合对照 品溶液，按上述的色谱条件连续进样6次，每次进样10ul, 计算灵芝酸a和灵芝酸b峰面积的rsd值分别为1.93%和 1.94%,表明仪器精密度良好

13、。2. 3. 4. 3重复性试验精密称取霍山菌盖样品6份，按 2. 3. 2项下方法制备供试品溶液并按照上述色谱条件测定， 计算得样品中灵芝酸a和灵芝酸b的峰面积的rsd值分别为 2. 30%和1.81%,表明该方法的重复性良好。2. 3.4.4稳定性试验 取样品溶液，按上述的色谱条件 分别在0、2、4、8、12、24h进样，进样量为10ul,计算 灵芝酸a和灵芝酸b峰面积的rsd分别为1. 39%和0. 92%, 说明样品在24h内稳定。2. 3. 4. 5回收率试验 精密称取已知含量的段霍芝1号菌盖粉末250mg 6份，分别精密加入灵芝酸a和灵芝酸b对计算回照品混合溶液1.5ml,按照样品

14、测定项下方法测定, 收率，结果见表3。2. 3. 5样品测定 取3种灵芝（霍芝1号、韩芝和日芝） 菌盖、菌柄粉末及鞄子粉，按2.3.2供试品溶液制备和2. 3. 1 色谱条件项下方法操作进行分析，测定结果见表4。从表4可以看出，霍芝1号、韩芝及日芝的不同药用部 位的灵芝酸a和灵芝酸b的含量存在明显差异，含量高低均 表现为：菌盖菌柄胞子粉，其中3种灵芝的砲子粉中未检 出灵芝酸a和灵芝酸b成分，可能因含量普遍较低所致。3讨论灵芝多糖、三菇类化合物是灵芝的主要活性成分，其含 量是衡量其质量的重要指标。灵芝的菌盖、菌柄及胞子粉这 3个部位在灵芝的生长发育过程中起着不同的功能和作用， 这必然会影响活性成

15、分的组成、结构、含量及药效等方面，因此很有必要对灵芝不同药用部位的活性成分含量进 行单独的研究。灵芝多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖血脂、 神经细胞保护等药理作用。在本研究中，霍芝1号、韩芝及 日芝不同药用部位的多糖存在一定的差异。从总体上看，砲 子粉总多糖含量明显高于菌盖及菌柄，菌盖总多糖略高于菌 柄总多糖且差异不明显。因此，如果以获得多糖为目标，可 以直接使用整个子实体作为原料。灵芝酸类成分是灵芝中主要活性成分，是灵芝药效物质 基础之一。本研究结果表明利用分光光度法及hplc法得出 的数据均显示3种灵芝的不同药用部位的三菇类化学成分含 量规律一致，均表现为菌盖菌柄鞄子粉，灵砲子粉中

16、三菇 类成分含量较低，尤其是hplc法测定时，在3种灵芝的胞 子粉中都没有检测到灵芝酸a和灵芝酸b,这些差异与药效 的相关性尚不明确，但应可以部分反映其质量。因此，要以 获得三菇类成分为指标，我们建议采用灵芝菌盖为材料。值 得一提的是，与hplc法相比分光光度法测得总三菇含量明 显偏高。因此，在进行药材质量分析时应根据具体目的选取 合理的方法。在对3种灵芝相同药用部位总多糖含量比较发现，菌盖 总多糖含量由高到低的灵芝依次是：霍芝1号韩芝日芝； 菌柄总多糖含量由高到低的灵芝依次是：霍芝1号韩芝日 芝；砲子粉总多糖含量由高到低的灵芝依次是：日芝霍芝1 号韩芝。在对三种灵芝相同药用部位总三菇含量比较

17、发现, 菌盖总三菇含量由高到低的灵芝依次是：日芝霍芝1号韩 芝；菌柄总三菇含量由高到低的灵芝依次是：韩芝霍芝1 号日芝；砲子粉总三菇含量由高到低的灵芝依次是：韩芝 霍芝1号日芝。在对三种灵芝相同药用部位灵芝酸a和灵 芝酸b含量比较发现，菌盖及菌柄的灵芝酸a和灵芝酸b含 量由高到低的灵芝依次是：霍芝1号日芝韩芝；鞄子粉中 未检测到这两种成分，无法进行比较。因此，从实际生产及 灵芝的药用价值两方面考虑，我们建议首选霍芝1号进行种 植培育。参考文献1林志彬灵芝的现代研究m.北京：北京医科大学、 中国协和医科大学联合出版社，1996： 145-146.2李颖博，李宇华，王瑞.灵芝多糖对肿瘤细胞与内 皮

18、细胞相互作用的影响j.中国药理学通报，2008, 24 (2)：250-253.3 mekkawy s, meselhy m, nakamura n. anti- hiv-1 and anti-hiv-1 protease substances from ganoderma lucidumj. phytochemistry, 2007, 9 (6)： 1651-1657.4 dudhgaonkar s , thyagarajan a , sliva d.suppression of the inflammatory response by triterpenes isolated from the mushroom ganoderma lucidumej.international immunopharmacology, 2009, 9 (11)： 1272-1280.5 马友龙，张学成，祁海艳，等.灵芝酸的研究进展 j河北