大鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定

1、大鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定作者：王光兰陈爽张丽红范颖石英爱孙华君刘晓会吴 珊【摘要】目的建立较好的大鼠近端肾小管上皮细胞原 代培养模型。方法无菌取wistar大鼠肾脏，取皮质剪碎， 经i型胶原酶消化和45%percoll连续密度梯度离心进行纯 化，用含10%胎牛血清的dmem/f12培养基原代培养并传代， 观察细胞形态并以免疫细胞化学染色及酶化学染色鉴定。结 果培养45d细胞融合成单层，呈典型的鹅卵石样，细胞角 蛋白18及碱性磷酸酶染色均呈阳性，细胞可传23代。结 论此法可在短期获得数量较多、重复性好的近端肾小管上皮 细胞，为体外研究肾小管细胞的病变提供了实验平台。【关键词】近端肾

2、小管上皮细胞；原代培养;大鼠【abstra ct】objectivetoesta blishthebettermodeofratproximaltubul tcs). methodswistar iletakenout,thenth dandshredded,purifigestionand45%percnsitygradientcentrandpassagedbydmem/lforprimaryculture eepithelialcells(p ratskidneywerester ecortexwasseparate iedbycollagenase i d olldiscontinuo

3、usde ifugation,culturedfi2mediumsupplemen ineserum,identifie nocytochemistrysta r4to5days,thecells oasinglelayerandshtedwithlo%fetalbov dbymorphology,immu iningandenzymeaftewereinosculatedintowedthetypicalcobb 1estoneellscouldbepassed2 1d1argequantityandgoodrepeatabilityptcsinshortterm ， thosecellsc

4、anprovideanexperimentalplatflikecytoke ratinl8andalkaline phosphatasestainin gwerepositive ， thee 3thismethodcanyie ormfortheresearcho fpathologicalchang esandlesions.【key words 】proximaltubu leepithelialcells；primarycultrue；rat肾脏纤维化是多种肾脏疾病发展至肾衰竭终末期的共 同表现，肌成纤维细胞在此过程中发挥重要作用。目前，肾 小管上皮细胞向间充质细胞转分化是纤维化过程

5、中成纤维 细胞和肌成纤维细胞的来源之一1）。因此，建立良好的近 端肾小管上皮细胞的体外培养模型，对于肾小管上皮细胞疾 病的研究十分重要，本实验旨在探讨的方法。1材料与方法主要材料、试剂体重180220g的雄性wista r大鼠（吉 林大学基础医学院实验动物中心）；i型胶原酶（sigma）;优级胎牛血清(hyclone);dmem /f12培养基(gibco);细胞角蛋 白18(ck18)多克隆抗体(北京博奥森公司)；sp试剂盒、dab试剂盒(福州迈新公司)。肾小管上皮细胞的分离培养大鼠实验前12h禁食，自由 进水。颈椎脱臼处死后，75%酒精浸泡5min,无菌取双肾， 置于冷中，去除肾蒂及包膜，

6、切取薄层肾皮质，剪碎至 lmm3大小，pbs洗3遍，离心800r/min，5min;所得沉淀加入 终浓度为lg/l的i型胶原酶，37°c振荡消化30min，将消化 后的组织碎块转移至80目不锈钢网上，过滤、研磨并用 dmem/f12培养基冲洗；网下液体再经200目筛网过滤后，1 000r/min离心5min。取沉淀用45%percoll分离液25ml重 悬制备细胞悬液。将细胞悬液小心铺于含5mll00%percoll 分离液的离心管中，14000r/min，4°c条件下离心25min可 见液体分层。吸取近管底第2层细胞悬液，即为近端肾小管 节段及其游离的上皮细胞。dmem

7、/f12培养1000r/min，10min 离心液洗除残留的percoll分离液。将分离的近端肾小管上 皮细胞用含10%胎牛血清的dmem/h2培养液重悬后接种于培 养皿中，于37°c，5%c02孵箱中静置培养，隔天换液。原代 培养45d后细胞长满，胰蛋白酶(含%edta)消化，待细胞 变圆后弃胰酶，加入含10%胎牛血清的dme m/f12培养液终 止消化并传代，继续培养。近端肾小管上皮细胞的鉴定倒置显微镜下观察培养细 胞的形状及生长情况。免疫细胞化学染色：制备细胞爬片， 定后以ck 18抗体为一抗，sp法进行免疫细胞化学染色，二抗为羊抗鼠/兔igg，阴性对照用pbs代替一抗。钙钴法

8、 碱性磷酸酶染色，作用底物为3 甘油磷酸钠。2结果1肾小管上皮细胞原代培养第4天（200x）形态学观 察经上述方法分离纯化后获得的大量肾小管节段及细胞，镜 下细胞圆形清亮，折光良好，状态甚佳，视野中仅见少量肾 小球掺杂。培养第2天即可在肾小管节段组织块周围见到大 量上皮样细胞，45d后可见细胞融合成单层，细胞间衔接 紧密，呈典型的多边形鹅卵石样，状态甚好（图1）。细胞经 首次1 : 3传代后贴壁迅速，生长良好，形状无明显改变。 但再次传代后细胞贴壁稍欠佳，生长减慢，第3代细胞贴壁 生长均不良，呈明显老化状态，此时残留的少量成纤维细胞 及系膜细胞样细胞生长渐成优势。免疫细胞化学染色原代培养和第1

9、次传代的细胞经ck 18免疫细胞化学染色证实所培养细胞均为阳性，表明为上 皮细胞，显微镜下胞浆中出现棕黄色颗粒，分布不均，强弱 不等，有少量空泡，苏木精复染细胞核着色浅淡（图2）。2传1代细胞ck 18免疫细胞化学染色（sp法，200碱性磷酸酶染色原代培养和第1次传代的细胞可见胞浆中有淡灰色、黑色颗粒，各细胞强弱不等，分布不均，表明为肾小管上皮细胞（图3）图3传1代细胞碱性磷酸酶染色（钙钴法，100 x）3讨论体外细胞培养作为一种常用的实验研究方法，其在病理 学、生理学及毒理学等各领域研究中的应用十分广泛。由于 肾小管上皮细胞参与多种肾脏疾病的发生发展，特别是近几 年研究发现多种肾脏疾病的终末

10、期改变一一肾纤维化的发 生也离不开肾小管上皮细胞的参与，加速了肾小管上皮细胞 体外培养技术的成熟。目前尽管已有不同动物的肾小管上皮 细胞体外培养细胞株，如猪llcpk1细胞株，人hk 2、hkc细胞株等，但这些细胞株的建立大部分经过基因转染技 术，使其在结构和功能等方面与体内正常的肾小管上皮细胞 有或多或少的差别，而原代细胞培养具有细胞性质与体内细 胞状况更相近的独特优势，是这些细胞株无法比拟的。本实验采用percoll密度梯度分离法获得的细胞数量较 多，分离后细胞原代培养活力甚佳、生长迅速。ck是上皮细 胞的特异性标记，据报道肾小管上皮细胞优先表迗ck 18, 但肾脏中肾小球上皮细胞也有ck

11、表迗2,3）。本研究经ck18免疫细胞化学染色显示获得的细胞为上皮细胞，为进 一步确认，本研究进一步检测了细胞的碱性磷酸酶。碱性磷 酸酶是近端小管上皮细胞刷状缘上的标志酶，只有近端肾小管上皮细胞该酶染色呈阳性，结果显示获得的原代培养细胞 碱性磷酸酶化学染色为明显阳性，且显微镜观察细胞形态呈 典型的鹅卵石样，均说明获得的细胞是近端肾小管上皮细胞。目前虽然已建立了几种肾小管上皮细胞的分离纯化方 法4)，但分离的细胞中时有少量的肾小球掺杂，本实验的 分离中也间有肾小球掺杂的现象，如何获得更为精纯的近端 肾小管上皮细胞尚需进一步摸索。另外，本实验体外培养的 细胞只能传代培养12次，再次传代时细胞状态欠佳，细 胞体外存活时间相对较短，考虑可能与选择的大鼠鼠龄较大 有关。添加一些利于细胞生长的物质如：胰岛素、转贴蛋白、三碘甲状原氨酸等能否延长其体外培养时间尚需进一步观 察。【参考文献】lfanjm,ngyy,hil1pa,etgrowthfactor0regulatestubularepithelialmyofibroblasttransdiffere ntiationinvitro j ).kidney ,1999；56 (4)： 145567.2蔡文琴，王伯沄.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技 术m).成都：四川科学技术出版社，1 994:102.3matt