In―Fusion克隆技术构建HBVX基因真核表达质粒

1、in-fusion克隆技术构建hbv x基因真核表达质粒摘 要目的：以血清中乙型肝炎病毒(hbv) dna 为模板，克隆构建hbv x蛋白质的真核表达载体pcdna-hbxo 方法：设计扩增hbv x基因的in-fusion pcr引物，采用高 保真dna聚合酶分两段扩增hbvx基因序列；采用in-fusion 克隆技术，将两段x基因扩增片段一步克隆入经hind iii 和xba i双酶切的pcdna3. 0真核表达载体，以构建重组真 核表达载体pcdna-hbx；采用hind iii和xba i双酶切和 dna序列测序筛选鉴定重组载体；pcdna-hbx转染hepg2细 胞，western

2、blot检测pcdna-hbx转染细胞的hbx蛋白质表 达。结果：in-fusion pcr引物分两段扩增获得全长hbx基 因序列；in-fusion获得克隆的pcdna-hbx经双酶切筛选得 到阳性重组质粒，测序分析证实插入序列正确；转染 pcdna-hbx 的 hepg2 细胞，western blot 证实表达 hbx 蛋白 质。结论：以血清hbv dna为模板克隆hbv x基因，构建了 表达hbv hbx蛋白质的真核表达载体，为hbx蛋白质的生物 学功能研究提供支持。关键词乙型肝炎病毒；hbvx基因；基因克隆；表达 载体；真核表达中图分类号:r511文献标识码：a文章编号:2055-5

3、200(2014) 02-001-05慢性乙型肝炎病毒(hepatitis b virus, hbv)感染 是肝癌发生的主要危险因素之一。hbv编码的分子中与肝癌 发生关系最密切的是x蛋白质，hbv x基因编码的x蛋白质 (the hepatitis b virus x, hbx)具有多种生物学功能， 可与宿主细胞多种蛋白质相互作用，调控宿主细胞基因表 达，影响宿主细胞的信号转导、细胞增殖与分化等，其对肝 细胞周期与凋亡的影响是hbv致肝癌发生的重要机制之一 1-3 o因此，克隆hbv x基因进行hbx蛋白生物功能研究 具有重要意义。由于血清hbv dna x基因的特殊结构，使得克隆x基因 较

4、为困难。血清hbv病毒颗粒的基因组长约3. 2kb,为带有 缺口的双链不完全环形结构dna,称为松弛环状dna(rcdna), 而x基因位于hbv基因组的1374bp1838bp,正位于缺口处, 而且该区域为高cg区。实验发现：当以血清hbv rcdna为 模板时，用普通pcr-次扩增全长x基因，或用pcr分段扩 增后再用pcr扩增拼接的x基因，所获得全长x基因扩增片 段经常会出现序列缺失现象4。为克服上述问题，我们釆用in-fusion克隆技术，将分 段扩增的x基因片段一次连接克隆入真核表达载体中。 in-fusion克隆技术是利用in-fusion enzyme可准确将末端 带有15个相互

5、重叠碱基序列的dna片段融合连接的特性， 将一个或多个外源基因片段一次克隆入目的质粒中5-6 o 目的克隆基因片段末端的15 bp重叠碱基序列，是通过特定 设计的in-fusion引物加到扩增片段的末端。in-fusion hd cloning kits试剂盒可快速准确地将一个或多个外源dna 片段克隆到载体任何位置7-8 o采用in-fusion技术，以 血清hbv dna为模板，分段扩增并拼接x基因，将x基因准 确地克隆入真核表达载体pcdna3. 0,获得了可表达hbx蛋白 质重组真核表达载体。为hex蛋白质的生物学功能研究提供 实验条件。1材料与方法1.1主要实验材料及仪器表达载体pc

6、dna?3. 0购自美国invitrogen生命技术公 司；高保真 pcr 扩增反应液 2xpfu pcrmastermix. tianamp 病毒dna提取试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶dna回收试剂 盒、感受态toplo购于天根生化科技（北京）有限公司；限 制性内切酶 hindlll 和 xba i、in-fusion hd ecodrytm cloning kit购自宝生物工程（大连）有限公司；hepg2细 胞株购于中国典型培养物保藏中心；鼠抗hbxag单克隆抗体、 辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体购于圣克鲁斯（santa cruz）生物技术公司；nanodrop2000核酸浓度分析仪（赛默

7、 飞世尔科技中国有限公司）。根据hbv rcdna x的结构特点， 拟分hbx1和hbx2两个片段扩增x基因，然后进行in-fusion 融合连接克隆，所用扩增引物（表1）用http: /bioinfo, clontech. com/infusion/在线软件设计；化学发 光底物（beyoecl plus reagent a, b, d3308）o表1用于in-fusion分段拼接克隆的pcr引物序列引物引物序列hbv基因组位置p1 gtttaaacttaagctt cttaccatggctgctcgg 1368-1385ntp2 gtggtctccatgcgacgtgcag 1618-159

8、7ntp3 tcgcatggagaccaccgtgaac 1604-1625ntp4 aaacgggccctctaga aggacatgaacatgagatgattagg 1858-1834nt注：pl下划线部分与pcdna3. 0 hindlll位点5，端15 个碱基重叠，黑体斜体序列为hindlll识别序列，其余部分 为x基因起始区域序列；p2、p3下划线序列为反向互补的 15个碱基；p4下划线部分与pcdna3. 0 xbal位点3，端15 个碱基重叠，黑体斜体序列为xbal识别序列，其余部分为x 基因终止区域互补序列。1.2实验方法和步骤1. 2. 1血清hbv dna的pcr扩增 采

9、用病毒dna提取试 剂盒分别提取4例hbv感染者血清hbv dna （hbv病毒血清 载量均大于106copies/ml）,按图1方案进行pcr扩增。pcr反应液配制:2xpfu pcr mastermix 12. 5?l,引物 pl 和 p2, 或引物p3和p4各1?l (15pmol), hbv dna样品3?l,去离 子水补至30?lo反应程序：98£预变性3min； 98°c变性30s, 6(tc退火30s, 72工延伸40s,循环30次；最后72工延伸 5mino pcr扩增产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下 切下270bp处的目的片段，用琼脂糖凝胶dn

10、a回收试剂盒回 收目的片段。用nanodrop2000核酸浓度分析仪测定回收的 核酸含量。图1 pcr分段扩增hbv x基因示意图注：p和p2引物扩增hbx1片段,p3和p4引物扩增hbx2片段；两扩增片段间有15个碱基的重叠序列，p1和p4引物的3,端15个碱基分别与pcdna3. 0载体hindlll和xbal双 酶切末端15个碱基序列重叠，上述重叠序列用于in-fusionenzyme融合连接克隆。虚线为hbv rcdna残缺的正链部分。1.2.2 in-fusion连接、转化及质粒鉴定 每个血清样品获得的pcr片段各10ng与hindlll和xbal线性化pcdna3. 0 载体50n

11、g溶于去离子水，溶液总体积为10?lo将该10?l溶 液加到一个in-fusion hd ecodry反应管中，用移液器将 管内in-fusion hd ecodry干粉彻底溶解。盖好盖后，反应 管于37°c孵育15min,然后50°c加热15min灭活in-fusion enzyme,完成融合连接反应(原理见图2),连接反应管置于 冰上待转化。取in-fusion连接反应液3?l与50?l感受态 toplo混合，按照in-fusion操作说明进行重组载体感受态 细胞转化，并接种于含氨节青霉素的lb培养皿中。37°ci± 夜培养后，挑取单克隆接种于10m

12、l lb液体培养基中，37°c 培养至菌体增殖对数增长期时，保存菌种，其余收菌提取重 组质粒，进行hindlll和xbal双酶切鉴定和dna测序。图2hbx基因扩增片段与酶切pcdna3. 0载体in-fusion 克隆连接示意图1.2.3转染细胞于60mm细胞培养皿中，接种5x105 个细胞，培养基为6ml含10%小牛血清的dmem, 5%c02培养 24ho当细胞融合度达到70%90%时进行转染操作，主要步 骤为：6ug质粒dna溶于600?l无血清dmem,然后加入12?l turbofect transfecion reagent转染试剂，混匀后室温放 置20min,将dna

13、和转染剂混合物全部加到60mm细胞培养皿 的培养基中，轻轻摇匀转染培养基。37°c 5% c02培养48h, 提取细胞总蛋白质。1. 2. 4 western blot分析 收集细胞蛋白质，bradford 测定蛋白质含量。取适量蛋白质样品进行sds-page凝胶电 泳。将凝胶中的蛋白质分子转到硝酸纤维素膜(nc膜)上。 转膜完毕后，膜用western封闭液(p0023b) 4£封闭过夜。 加入稀释(1： 500)的鼠抗hbx单克隆抗体(sc-57760, santa cruz公司)，4£摇动孵育6ho以稀释的(1： 1000)辣根 过氧化物酶(hrp)标记的兔抗

14、小鼠igg作为二抗。加入化 学发光底物，用化学发光成像仪检测hbx蛋白质条带。actin 抗体(aa128)作为内参。2结果与讨论2. 1 pcr扩增采用 in-fusion pcr 引物 pl 和 p2、p3 和 p4,分别 pcr 扩增血清hbv dna样品，每个样品获得266bp和270bp扩增 产物(见图3)o pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，回收凝胶 中特异pcr产物条带，最后获得3050ng/?l浓度不等的扩 增产物水溶液待用。图3 pcr产物琼脂糖电泳图谱注：1和2、3和4、5和6、7和8分别为不同样品x基 因的xi和x2片段，xi片段大小为266bp, x2片段大小为 270

15、bp； m 为分子量 marker dl2000o2.2 in-fusion连接克隆4个血清hbv dna均获得克隆菌落，重组质粒hindlll 和xbal双酶切鉴定，均可切出长度为491bp插入的x基因 的目的片段(见图4)。对重组质粒进行dna测序，测序结果 采用 http：/www. ncbi. nlm. nih. gov/blast 与 hbv genotype c (locus: ab033556)序列进行比对(见图5),结果4株克 隆序列与c基因型hbv x基因序列的同源性均大于97%(480/491=97. 76% , 481/491=97. 96 , 482/491=98. 1

16、7% , 482/491=98. 17%),4株克隆hbvx基因序列之间均大于98%。 证明采用in-fusion技术方法将血清hbv dna x基因克隆入 pcdna3. oo图4重组质粒pcdna-hbx双酶切电泳图谱注：1, 3分别为两个未经酶切的pcdna-hbx质粒；2, 4 分别为经hindhi和xbal双酶切的图谱，上方条带为线性 pcdna质粒(5. 6kb),下方条带为目的x基因片段，大小为 491bp； ml 为 d2000 分子量标准；m2 为 lkb dna ladder 分 子量标准。2. 3 western blot 检测用pcdna-hbx转染hepg2细胞，提取

17、细胞蛋白质进行 western blot,采用hbx蛋白质特异单克隆抗体进行检查。 结果可见相对分子量约为17 kda的hbx条带出现，而未转 染和转染pcdna空载体的hepg2细胞中未检出hbx蛋白质(见 图6)。说明所构建的hbx真核表达载体pcdna-hbx可在hepg2 细胞中表达hbx蛋白质。图6 wester blot印迹实验结果注：1.用转染hbx表达载体pcdna-hbx的hepg2细胞 提取的蛋白质样品，显示有17kda的hbx蛋白质表达；2.用 转染pcdna3. 0质粒的hepg2细胞提取的蛋白质样品；3.用 未转染的hepg2细胞提取的蛋白质样品。m：标准分子量蛋 白

18、质分子。3结论采用in-fusion克隆技术分段扩增并克隆带有缺口的hbx基因，可获得保真度高的重组克隆。由于hbv dna为松 弛环状dna，其x基因区存在两个缺口，同时该区gc含量较 高，尤其是hbx1区域，gc含量高达65%3,因此用传统的 跨越缺口一步pcr扩增，获得全长x基因序列并不容易，经 常发生克隆序列存在缺失或插入现象，造成克隆序列失真， 影响表达x蛋白质的功能。in-fusio n克隆技术是基于in-fusion dna连接酶可以高效、准确识别并融合两个具有 15个碱基重叠序列的dna片段，避免了仅依靠退火温度，控制dna片段间拼接而造成的非特异结合。采用分段扩增x基 因，可

19、以避免x基因序列缺口对扩增效率和保真度造成的影 响，同时采用针对gc含量较高区域的高保真dna聚合酶pcr 反应体系，保证扩增获得的两个x基因片段具有高保真度。扩增获得的两个x基因片段末端间、以及与载体的酶切末端 都带有15个特异重叠序列，in-fusiondna连接酶可以按照 序列，准确地将它们连接起来，获得重组质粒。与常规pcr引物设计相比，虽然in-fusion pcr引物设计稍显 复杂，但通过专业引物设计软件(http : /bioinfo, clontech. com/infusion/),只需提供载体的多 克隆序列、限制性内切酶以及扩增片段的引物序列，即可完 成引物设计；另外，in

20、-fusion克隆方法不受插入片段3' 端是否有突出a的影响，因此可以采用任何热稳定性dna聚 合酶进行目的片段的扩增9-11 o 本研究所用的克隆iibv x基因方法，可准确、快速从血 清hbv dna样品中克隆x基因，为hbv感染中x基因研究提 供了有效技术手段。为克隆带有缺口基因提供借鉴同时，也 为多基因克隆以及基因定点突变提供解决方案。参考文献1 hongxia fan, xiaoli yan, yu zhang, et at.increased expression of gp96 by hbx-induced nf- k b activation feedback enha

21、nces hepatitis b virus productionj.plos one, 2013,8 (6)：655-688.2 julie luciforal , silke arzberger, daviddurantel, et al. mlrike protzer hepatitis b virus x protein is essential to initiate and maintain virus replication after infec tio nj journal of hepa to logy, 2011,55 (5)： 996-1003.3 gilad doit

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23、2624 - 2636.6 mohamed karamoko, sara cline, kevin redding,et al. lumen thiol oxidoreductasel , a disulfide bond-forming catalyst, is required for the assembly of photosystem ii in arabidopsis j. plant cell, 2011, 23 (12)：4462- 4475.7 tian luo, jeeba a kuriakose, et al. ehrlichiachaffeensis trp120 interacts with a diverse array of eukaryotic proteins involved in transcription , signaling,