激光扫描共聚焦显微镜技术讲座 ppt课件

1、 采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上，使用紫外或可见光激发荧光探针，采用共轭聚焦原理和装置，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套集观察、分析和输出为一体系统。它把光学成像的分辨率提高了30%40%，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。hippocampus neurons expressing gfp荧光显微镜lscm显微镜成像清晰度的决定因素显微镜成像清晰度的决定因素: : 1. 1.分辨率分辨率2. 2.球差球差3.3.色差色差1 1、分辨率：、分辨

2、率： 指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离来表示。0.25 m25 mm2 2、球差：、球差： 由主轴上某一物点向光学系由主轴上某一物点向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该统发出的单色圆锥形光束，经该光学系列折射后，光学系列折射后， 不能聚焦成不能聚焦成一点一点, ,使成像模糊不清使成像模糊不清,形成一弥形成一弥散光斑散光斑(俗称模糊圈俗称模糊圈)，则此光学，则此光学系统的成像误差称为球差。系统的成像误差称为球差。3、色差：色差： 由白色物点向光学系统发出一束由白色物点向光学系统发出一束白光，经该光学系列折射后，组成该白光，经该光学系列折射

3、后，组成该束白光的红、橙、黄、绿、青、蓝、束白光的红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各色光，不能会聚于同一点，即紫等各色光，不能会聚于同一点，即白色物点不能结成白色像点，而结成白色物点不能结成白色像点，而结成一彩色像斑的成像误差，称为色差。一彩色像斑的成像误差，称为色差。激光扫描共聚焦显微镜荧光显微镜激光扫描共聚焦显微镜中常见的激光器激光扫描共聚焦显微镜中常见的激光器 ar激光器激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm hene : 543nm,633nm 固体激光器固体激光器(uv): 405nm激光器的特点激光器的特点: 1) 方向性好方向性好: 激光基本延直线传播激光基本

4、延直线传播 2) 单色性好单色性好 :=10-8nm 3) 高亮度高亮度: 激光方向性好激光方向性好, 其在空间上的能量分布是高其在空间上的能量分布是高 度集中的。度集中的。 4) 偏振性偏振性: 激光为平面偏振光激光为平面偏振光, 光纤耦合光纤耦合leica dm irbe 倒置荧光显微镜lscm物镜的重要参数 na 数值孔径又叫做镜口率，简写为n.a。是物镜的主要技术参数，是判断物镜性能高低的重要标志。 n.a=n*sin a/2 n：物体与物镜间媒质的折射率 a2：物镜孔径角的一半 溴萘折射率1.66，香柏油1.515，玻璃1.52，水的为1.3，空气为1。香柏油与玻璃折射率相似，故光折

5、射少，透光率高，成像清楚。 n.a. 越大：放大倍数越大，分辨率越高， n.a. 越大：视场宽度与工作距离越小 4x 20 x 10 x 40 x 60 x 100 x 分析软件控制软件+图1. 共聚焦显微镜简化原理图 用于激发荧光的激光束用于激发荧光的激光束(laser)透过入射小孔透过入射小孔(light source pinhole)被二向色镜被二向色镜(dichroic mirror)反射，通过显微物镜反射，通过显微物镜(objective lens)汇聚后入射于待观察的标本汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点内部焦点(focal point)处。激光照射所产生的荧光处

6、。激光照射所产生的荧光(fluorescence light)和少和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔(detection pinhole)到达光电探测到达光电探测器器(detector)（通常是光电倍增管（通常是光电倍增管（pmt）或是雪崩光电二极管（）或是雪崩光电二极管（apd），变成），变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，电信号后送入计算机。而由于二向色

7、镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。不会被探测到。共轭普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜的区别zxyxy平面optical sections collected simultaneously at three different excitation wavelengths (488, 568, and 647 nanometers). the specimen is the fruit fly third instar wing imaginal disk. xyxy平面xyxy平面timetime-lapse imaging of a

8、 living fruit fly embryo injected with calcium green is presented in figure 2. the series of images shows the change in distribution of the fluorescent probe over time. 0 s10 s20 s30 speripheral nervous system of a fruit fly embryo zxyxy平面观察活细胞、活组织：在不损伤细胞的前提下,对活组织、活细胞进行观察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期处理过程(如脱水、脱蜡

9、、染色等);而且观察过的样品还可以继续用于其他的研究。这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为重要。这可以说是最大的优势。6 生化成分精确定位观察配合专用的分子探针,对于要检测的成分不仅可以定位到细胞水平,还可以定位到亚细胞水平和分子水平。7 动态观察在同一样品平面上随时间进行连续扫描,就可分析细胞结构、内含、和标记等动力学变化。目前在这方面做得最多的是使用观察心肌或平滑肌细胞内游离钙、钠、钾离子浓度或的动态变化。8 定量测量：首先应用专一的荧光探针对样品进行染色,样品的荧光强度和所测成分的含量呈正比,如果其余条件固定,通过对比各组样品之间的荧光强度值,可得出特定成分的含量比。合适的荧光探针是有效

10、地进行实验并获取理想实合适的荧光探针是有效地进行实验并获取理想实验结果的保障。验结果的保障。(1)现有仪器所采用的激光器现有仪器所采用的激光器(2)荧光探针的光稳定性和光漂白性荧光探针的光稳定性和光漂白性(3)荧光的定性或定量荧光的定性或定量 定性定性:单波长激发探针单波长激发探针 定量定量:双波长激发比率探针双波长激发比率探针(4)荧光探针的特异性和毒性。荧光探针的特异性和毒性。(5)荧光探针适用的荧光探针适用的ph * 不同的不同的荧光探针荧光探针在不同在不同标本标本的效果常有差的效果常有差异，故除综合考虑以上因素以外，有条件者应进异，故除综合考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的行染料的

11、筛选筛选，以找出最适的荧光探针。，以找出最适的荧光探针。* 许多荧光探针是许多荧光探针是疏水性疏水性的，很难或不能进的，很难或不能进入细胞，需使荧光探针与入细胞，需使荧光探针与am（乙酰羟甲基酯）（乙酰羟甲基酯）结合后变成不带电荷的结合后变成不带电荷的亲脂性化合物亲脂性化合物方易于通过方易于通过质膜进入细胞，在质膜进入细胞，在细胞内细胞内荧光探针上的荧光探针上的am被非被非特异性特异性酯酶水解酯酶水解，去掉，去掉am后的荧光探针不仅可后的荧光探针不仅可与细胞内的靶结构或靶分子结合且不易透出质膜，与细胞内的靶结构或靶分子结合且不易透出质膜，从而能有效的发挥作用。从而能有效的发挥作用。xenopus oocytescalcium green用细胞内液稀释calcium green导入微注射器以20nl/oocyte注射卵母细胞18c避光放置40分钟共聚焦显微镜观察h