生物选修三第一章基因工程的原理和技术PowerPoint 演示文稿

1、 第一章第一章 基因工程基因工程第二节第二节 基因工程的原理和技术基因工程的原理和技术基因工程的基本原理基因工程的基本原理：让人们感兴趣的基让人们感兴趣的基因（目的基因）在宿主细胞中稳定和因（目的基因）在宿主细胞中稳定和高效表达。高效表达。基因工程的基本操作步骤：基因工程的基本操作步骤：1 1、获得目的基因、获得目的基因2 2、形成重组、形成重组DNADNA分子分子3 3、将重组、将重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞4 4、筛选含有目的基因的受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞5 5、目的基因的表达、目的基因的表达一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的

2、基因主要是指_请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的方法、获取目的基因的方法-适用于目的基因的序列为未知的适用于目的基因的序列为未知的-适用于目的基因的序列为不是很大且已知的适用于目的基因的序列为不是很大且已知的获取目的基因的方法获取目的基因的方法1 1）鸟枪法：）鸟枪法：供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶载入载入受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离受体细胞受体细胞( (直接分离法直接分离法) )2 2）反转录法：）反转录法： 目的基因的目的基因的mRN

3、AmRNA单链单链DNADNA双链双链DNADNA( (即目的基因即目的基因) )反转录反转录合成合成( (人工合成法人工合成法) )获取目的基因的方法获取目的基因的方法3 3）根据已知的氨基酸序列合成）根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ：蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成( (人工合成法人工合成法) )获取目的基因的方法获取目的基因的方法依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在

4、染色体上的位置基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性。基因翻译产物蛋白质等特性。一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的方法、获取目的基因的方法-适用于目的基因的序列为未知的适用于目的基因的序列为未知的-适用于目的基因的序列为不是很大且已知的适用于目的基因的序列为不是很大且已知的. .9 9PCRPCR是由美国科学家是由美国科学家穆利斯提出的一种穆利斯提出的一种体外体外简化条件简化条件下下模拟模拟DNADNA体内复制的体内复制的DNADN

5、A快速扩增快速扩增的方法，此技术的方法，此技术获得获得19931993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。(2)(2)利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ _ 、 _._.前提条件：前提条件：原理：原理：_方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制模板模板( (已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列) )四种脱氧核苷酸四

6、种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增必须对目的基因有一定的了解，必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物需要设计引物过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性25-6525-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的

7、作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链. .1212PCR原理原理. .1313PCR原理原理变性变性. .1414PCR原理原理退火退火. .1515PCR原理原理延伸延伸. .1616PCR原理原理变性变性. .1717PCR原理原理退火退火. .1818PCR原理原理延伸延伸. .1919PCR原理原理变性变性. .2020PCR原理原理复性复性. .2121PCR原理原理延伸延伸. .2222 PCRPCR反应曲线反应曲线. .2323 PCRPCR反应曲线反应曲线

8、理论上，理论上，PCRPCR反应产物呈指数增长，但这种增长形式在扩增反应产物呈指数增长，但这种增长形式在扩增25-3025-30个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台。此时扩增个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台。此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。人工合成：若基因人工合成：若基因_，核苷酸序列又，核苷酸序列又 _ _ ，则可用此法。，则可用此法。较小较小已知已知用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。2 2、形成重组、形成重组

9、DNADNA分子分子将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同. .2626表达载体应包括：表达载体应包括：启动子启动子目的基因目的基因终止子终止子标记基因标记基因转录的起点转录的起点转录的终点转录的终点3 3、将重组、将重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞方法方法将目的基因导入将目的基因导入动物细胞

10、动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞基因工程的受体细胞有哪些？如何选择？基因工程的受体细胞有哪些？如何选择？如何导入？如何导入？3. 不同受体细胞导入的方法不同：（1）植物细胞：农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法基因枪基因枪.29农杆菌转化法农杆菌转化法农杆菌农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物感染大多数双子叶植物的受伤部位，的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发

11、状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有细胞中分别含有TiTi质粒和质粒和RiRi质粒质粒，其上有一段其上有一段T-DNAT-DNA，农，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将可将T-DNAT-DNA插入到植插入到植物基因组中物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。系。人们将目的基因插入到经过改造的人们将目的基因插入到经过改造的T-DNAT-DNA区区，借助农，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与

12、整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。.30农杆菌转化法农杆菌转化法农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物感染大多数双子叶植物的受伤部位，的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有细胞中分别含有TiTi质粒和质粒和RiRi质粒质粒，其上有一段其上有一段T-DNAT-DNA，农，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，杆菌通过侵染植物伤口进入细

13、胞后，可将可将T-DNAT-DNA插入到植插入到植物基因组中物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。系。人们将目的基因插入到经过改造的人们将目的基因插入到经过改造的T-DNAT-DNA区区，借助农，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了

14、广泛应用。化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。.31基因枪法：基因枪法： 将直径将直径4um4um的钨粉或金粉在供体的钨粉或金粉在供体DNADNA中浸泡，然后用基因枪中浸泡，然后用基因枪将这些粒子打入细胞、组织或器官中将这些粒子打入细胞、组织或器官中，具有一次处理多个细胞的优点，但转化，具有一次处理多个细胞的优点，但转化效率较低，另外这种方法也用于基因治疗和抗体制备，并已取得初步成效。这效率较低，另外这种方法也用于基因治疗和抗体制备，并已取得初步成效。这一方法是依靠一种基因枪来帮助导入外源基因。基因枪根据动力系统可分为火一方法是依靠一种基因枪来帮助导入外源基因。基因枪根据动力系

15、统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。药引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。其基本原理是通过动力系统将带有基其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNADNA吸附在表面，以一定的速度射进植物细吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。现稳定转化的目的。它具有应用面广，方法简单，转化时间短，转化频率高，它具有应用面广，方法简单，转化时间短，转化频率高，实验费用低等优点。对于农杆菌不能感染的植物

16、，采用该方法可打破载体法的实验费用低等优点。对于农杆菌不能感染的植物，采用该方法可打破载体法的局限。基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒局限。基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系。的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系。.32花粉管通道法:在在授粉后向子房注射含目的基因的授粉后向子房注射含目的基因的DNADNA溶液溶液，利，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源将外源DNADNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合导入受精卵细胞，并进一步地被整

17、合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体为带转基因的新个体。该方法于。该方法于8080年代初期由我年代初期由我国学者周光宇提出，国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。工作者易于掌握。. .3333（2）动物细胞： 显微注射法在在显微镜显微镜

18、下，用一根下，用一根极细的极细的玻璃针玻璃针( (直径直径1 12 2微米微米) )直接将直接将DNADNA注射到胚胎的细胞核注射到胚胎的细胞核内内，再把，再把注射过注射过DNADNA的胚胎移植到动物体的胚胎移植到动物体内内，使之发育成正常，使之发育成正常的幼仔，使用这种方的幼仔，使用这种方法进行外源基因整合法进行外源基因整合成功率约为成功率约为1010.34n显微注射法显微注射法: 动物转基因技术动物转基因技术。在显微镜下，用一根极细的玻璃在显微镜下，用一根极细的玻璃针针(直径直径12微米微米)直接将直接将DNA注射到胚胎的细胞核注射到胚胎的细胞核内内，再把注射过再把注射过DNA的胚胎移植到

19、动物体内的胚胎移植到动物体内，使之，使之发育成正常的幼仔，使用这种方法进行外源基因整发育成正常的幼仔，使用这种方法进行外源基因整合成功率约为合成功率约为10（3 3）以大肠杆菌为受体细胞：）以大肠杆菌为受体细胞： 将细菌将细菌用用CaClCaCl2 2处理，以处理，以增大细菌细胞增大细菌细胞 壁的通透性壁的通透性感受态细胞感受态细胞大肠杆菌经大肠杆菌经CaCa离子离子处理后可摄取外源处理后可摄取外源DNA,DNA,处于这种状态的细胞即感受态细胞处于这种状态的细胞即感受态细胞常常以微生物作为受体细胞的原因：以微生物作为受体细胞的原因： 繁殖快、结构简单繁殖快、结构简单.36n感受态细胞感受态细胞

20、 大肠杆菌经大肠杆菌经Ca离子处理后可摄取外源离子处理后可摄取外源DNA,处处于这种状态的细胞即感受态细胞于这种状态的细胞即感受态细胞（competent cells）。感受态细胞的用途光）。感受态细胞的用途光泛，可应用于基因重组、基因建库、基因克隆泛，可应用于基因重组、基因建库、基因克隆等领域。海基生产的感受态细胞是采用大肠杆等领域。海基生产的感受态细胞是采用大肠杆菌经特殊工艺处理得到的，可用于菌经特殊工艺处理得到的，可用于DNA的化学的化学转化，转化效率达到转化，转化效率达到108-109 cfu/g质粒，质粒，不仅可以转化质粒，而且非常适合于转化普通不仅可以转化质粒，而且非常适合于转化普

21、通的连接产物，特别适合于平端连接等需要高转的连接产物，特别适合于平端连接等需要高转化效率的转化要求化效率的转化要求 。 通过标记基因，进行筛选和检测通过标记基因，进行筛选和检测 导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组重组DNADNA分子吗？分子吗？真正能摄入重组真正能摄入重组DNADNA分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。4 4、筛选含有目的基因的受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞 怎样进行检测？举例说明怎样进行检测？举例说明检测检测检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转

22、录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质鉴定鉴定 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交抗原抗体杂交抗原抗体杂交5 5、目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达个体水平的检测：个体水平的检测： 性状的表达性状的表达分子水平的检测：分子水平的检测：DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 两种生物的两种生物的DNADNA单链之间互补程度越高，通过分单链之间互补程度越高，通过分子杂交形成双螺旋片段的程度也就越高，二者子杂交形成双螺旋片段的程度也就越

23、高，二者的亲缘关系就越近；反之，亲缘关系就越远。的亲缘关系就越近；反之，亲缘关系就越远。所以，可以通过所以，可以通过DNADNA分子杂交技术来鉴定物种之分子杂交技术来鉴定物种之间亲缘关系的远近。间亲缘关系的远近。 检测检测检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质鉴定鉴定 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交抗原抗体杂交抗原抗体

24、杂交5 5、目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达个体水平的检测：个体水平的检测： 性状的表达性状的表达分子水平的检测：分子水平的检测：用棉铃饲喂棉用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后中铃虫，如虫吃后中毒死亡，则说明摄毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得入了抗虫基因并得到表达。到表达。通过基因工程得到抗虫棉，怎样证明抗虫基通过基因工程得到抗虫棉，怎样证明抗虫基因已经在棉花细胞中表达？因已经在棉花细胞中表达？. .4444总结总结：基因工程的操作流程及要点筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞某研究所的研究人员将某研究所的研究人员将生长激素基因生长激素基因通过质通过质料介导进入大肠杆菌细胞内，

25、以表达产生生料介导进入大肠杆菌细胞内，以表达产生生长激素。已知质粒中长激素。已知质粒中存在两个抗性基因存在两个抗性基因，如，如图所示。图所示。目的基因不插入到氨苄青霉素抗性目的基因不插入到氨苄青霉素抗性基因中基因中，而大肠杆菌不带有任何抗性基因。，而大肠杆菌不带有任何抗性基因。如何筛选含有生长激素基因的大肠杆菌？如何筛选含有生长激素基因的大肠杆菌？. .46461为了培育节水高产品种，科学家将大麦中与抗旱为了培育节水高产品种，科学家将大麦中与抗旱节水有关的基因导入小麦，得到转基因小麦，其节水有关的基因导入小麦，得到转基因小麦，其水分利用率提高了水分利用率提高了20%。这项技术的遗传学原理。这项

26、技术的遗传学原理是是A基因重组基因重组 B基因突变基因突变 C基因复制基因复制 D基因分离基因分离巩固练习巩固练习【答案：答案：A】2利用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因培育的抗虫棉是利用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因培育的抗虫棉是否成功，最好检测否成功，最好检测A是否有抗生素产生是否有抗生素产生 B是否有目的基因表达是否有目的基因表达C是否有抗虫的性状出现是否有抗虫的性状出现 D是否能分离到目的基因是否能分离到目的基因 巩固练习巩固练习【答案：答案：C】3水母发光蛋白由水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中天冬氨个氨基酸构成，其中天冬氨酸、甘氨酸和丝氨酸构成发光环，现已将这种蛋酸、甘氨酸和丝氨酸构成发光环

27、，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是术中，这种蛋白质的作用是A促使目的基因导入受体细胞促使目的基因导入受体细胞 B促使目的基因在受体细胞内复制促使目的基因在受体细胞内复制C使目的基因容易被检测出来使目的基因容易被检测出来 D使目的基因容易成功表达使目的基因容易成功表达巩固练习巩固练习【答案：答案：C】4 4根据根据mRNAmRNA的信息推出获取目的基因的方法是（）的信息推出获取目的基因的方法是（）A A、用用DNADNA探针测出目的基因探针测出目的基因B B、用用mRNAmRNA探针测出目的基因探针测出目的基因C C、用用mRNAmRNA反转录形成目的基因反转录形成目的基因D D、用用PCRPCR技术扩增技术扩增mRNAmRNA巩固练习巩固练习【答案：答案：C】5 PCR5 PCR技术扩增技术扩增DNA,DNA,需要的条件是