鸡肝过氧化氢酶的提取、分离和纯化

1、鸡肝过氧化氢酶的提取、分离和纯化孙文刚云南民族大学化学与生物技术学院 云南 昆明摘要： 新鲜鸡肝经匀浆、磷酸缓冲溶液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose离子交换层析、Sepharcy1 S -200凝胶过滤层析、得到鸡肝过氧化氢酶电泳纯制品。回收率为18.23%，比活达4780.38U/mg，纯化倍数为66.15，最适温度为40，最适PH为7.0。该酶在2040，PH 58内稳定。经凝胶过滤和SDS-PAGE测得该酶的全分子量为250KD,亚基分子量为62.5KD。关键词： 家鸡；肝脏；过氧化氢酶；分离纯化；性质Chicken liver Catalase of Extracti

2、on, Separation and PurificationWengang SunYunnan Minzu UniversityAbstract: A catalase was purified from Anas Chicken homogenation ,n-butanol disposal, ammo-nium sulfate precipitation, ion-exchange chromatography on DEAE-Sepharose Fast Flow column and gelfiltration chromatography on Sephacryl S-200.T

3、he purity of the purified catalase was confirmed by thepresence of a single band on SDS-PAGE.18.23% of the catalase activity was recovered. The specific activ-ity was 4 780.38 U/mg. The optimum pH and optimum temperature were 7.0 and 40 ,respectively. The catalase appeared to be stable at 2040and pH

4、 58,and it was 66.15-fold purified. Sephacryl S-200 chromatography and SDS-PAGE showed that the molecular weight of this catalase was 250 KD and itssubunit was about 62.5 KD.Key words: Anas Chicken; liver; catalase; purification; property引言过氧化氢酶(Catalase,EC1.11.1.6，简称CAT)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶，酶分

5、子结构中含有铁卟啉环,1个酶蛋白分子中含有4个铁原子1。过氧化氢酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一2，催化细胞内过氧化氢的分解。过氧化氢酶已成为农业及相关食品业、乳制品业、造纸业以及农业环保业中有价值的酶之一。CAT主要以与细胞器，如线粒体、过氧化物酶体结合的形式存在,而在红细胞中则以可溶状态存在。过氧化氢酶几乎普遍存在于所有能呼吸的生物体内，在哺乳动物的肝与红细胞中含量较高，国内外学者多从动物肝中提取1,3-6,也有从血液、胎盘、贻贝、苹果以及微生物中提取的研究7-13。但从鸡肝中分离纯化过氧化氢酶的研究未见报道。为此，本文尝试从鸡肝中分离纯化过氧化氢酶并研究其相关的酶学

6、特性。1. 材料与方法1.1 实验材料家鸡肝脏取自健康活鸡,杀死后立即取肝脏于冰箱中冰冻保存备用14。1.2 实验仪器紫外分光光度计、冷冻离心机、超声波破碎仪、可见分光光度计、离子交换柱、SDS-PAGE电泳装置、冰箱、酶标仪等。13实验试剂 Tris试剂、甘油、KCl、HCl、硫酸铵、牛血清蛋白、磷酸缓冲液、考马斯亮蓝G-250、95乙醇、钼酸铵、过氧化氢、30%丙烯酰胺凝胶贮存液、SDS聚丙烯酰胺等。2实验方法2.1 粗酶液的制备称取新鲜鸡肝100g,用自来水洗净，再用消毒双蒸水漂洗干净。按15(MV)的比例加入预冷的0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.2),用高速组织捣碎机捣碎,置于

7、4冰箱抽提2h；离心(6000r/min,4,30min),收集上清液；加入硫酸铵至40%饱和度，离心(6000r/min,4,30min)去沉淀,上清中再加硫酸铵至60%饱和度，离心收集沉淀；将沉淀重溶于0.05 mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.2)中,4透析夜，然后按11(VV)的比例向透析液中加入预冷的正丁醇进行脱脂,4静置过夜.然后6000r/min离心,弃去沉淀以及正丁醇层,重复2次,得粗酶液。2.2 DEAE-Sepharose离子交换层析DEAE-Sepharose离子交换层析柱为通用安玛西亚公司生产的DEAE Sepharose Fast Flow 5mL预装柱,用磷酸缓冲液

8、(0.05mol/L,pH7.2)平衡至少4倍柱体积(20mL),上样5mL。用01mol/L NaCl溶液(含0.05 mol/L,pH7.2的磷酸缓冲液)进行梯度洗脱,流速30mL/h,每管收集5mL,紫外监测波长为280nm;测定各管过氧化氢酶活性和蛋白含量;收集活性较高的各管酶液,4透析过夜,冷冻干燥后进行凝胶过滤。2.3 SephacrylS-200凝胶过滤柱层析SephacrylS-200凝胶柱按产品说明书要求处理,装柱(16mm×835mm)后,用磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH7.2)冲洗一定体积,上样2mL。用磷酸缓冲液(0.05 mol/L,pH7.2)进行洗

9、脱,流速18mL/h,每管收集3mL；测定每管过氧化氢酶活性和蛋白含量;收集活性较高的各管酶液,4透析、冷冻干燥,得到过氧化氢酶纯品。2.4 过氧化氢酶活性测定以过氧化氢为底物,采用钼酸铵终止法15:取0.16 mol/L的过氧化氢溶液0.2mL,加入1.29mL磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH7.2)中,37温浴5min,再加入0.01mL过氧化氢酶液,立即混匀并计时1min,然后加入1.5mL 32.4mmol/L钼酸铵溶液终止反应,405nm测定其OD值；以先加钼酸铵,再加酶液的为对照.过氧化氢酶活性单位定义为:每分钟分解1mol过氧化氢所需的酶量为一个酶活力单位。2.5蛋白质含量测

10、定按Lowry法16和分光光度法17进行测定,以牛血清白蛋白为标准样品。2.6 蛋白质分子量测定用凝胶过滤18和SDS-PAGE测量其全分子量和亚基分子量,SDS-PAGE的分离胶浓度为12%,电泳后用考马斯亮蓝R-250染色。2.7 最适pH及pH稳定性37下,分别测定过氧化氢酶在不同pH(312)19缓冲液下的酶活性以及4放置48 h后的酶活性。2.8 最适温度及热稳定性分别测定过氧化氢酶在不同温度(2570)20下的酶活性,以及在上述不同温度下分别保温10,30,60min后酶的活力。2.9 反应初速度V0的测定在最适条件下,在12 min内,每隔20s测定一次过氧化氢酶活性,以时间为横

11、坐标,以底物浓度的减少量为纵坐标作图,得一直线,其斜率即是酶促反应的初速度V021。2.10 酶Km值及Vm的测定在最适条件下,以不同浓度的过氧化氢为底物,测定其酶活性,并按双倒数法(Lineweaver-Burk法)作图22,求出Km以及Vmax,底物浓度范围设置为4.737.5mmol/L。2.11 金属离子对酶活性的影响在测活体系中加入不同的金属离子,使金属离子的终浓度达到1 mmol/L,4放置48h后,37下测定活性,以不加金属离子的酶活力为100%.金属离子分别为:Pb2+,Ba2+,Cu2+,As3+,Mg2+,Mn2+,K+,Cr3+,Ag+,Fe2+。2.12 化学试剂对酶活

12、性的影响在体系中分别加入不同浓度的化学试剂EDTA、抗坏血酸、尿素,4放置48h后,37下测定活性,以不加化学试剂的酶活力为100%。3. 结果与分析3.1鸭肝过氧化氢酶的分离纯化粗酶液经DEAE-Sepharose离子交换层析柱后,所得结果如(图1)所示,收集有活性的各管洗脱液,经透析、浓缩后,再经过Sephacryl S-200凝胶柱,所得结果如(图2)所示.纯化后的过氧化氢酶经SDS-PAGE,显示为一条带(图3),说明该酶纯化已经达到电泳纯,酶的整个分离纯化结果见表1.图1. 鸡肝过氧化氢酶的DEAE Sepharose离子交换柱层析图2. 鸡肝过氧化氢酶的Sephacryl S-20

13、0凝胶柱层析M分子标准样品marker；1.鸡蛋清溶菌酶14.4KD；2.胰蛋白酶抑制剂20.1KD；3.牛碳酸酐酶31KD；4.兔肌动蛋白43KD；5.牛血清蛋白66.2KD；6.兔磷酸化酶B 97.4KD；S.过氧化氢酶图3.鸡肝过氧化氢酶SDS-PAGE电泳表1.鸡肝过氧化氢酶的分离纯化步骤总蛋白质/mg总活力/U 比活/(U/mg)回收率/%纯化倍数样品液30908.002233710.0072.27100.001.00粗酶液4158.801833450.40440.8682.086.10离子交换层析DEAE-sepharose280.01565809.992020.6825.3327

14、.96Sephacryl凝胶层析85.21407320.104780.3818.2366153.2 鸡肝过氧化氢酶分子量测定 SephacrylS-200凝胶层析测得鸭肝过氧化氢酶的全分子量为250KD,SDS-PAGE法测定其多肽链分子量为62.5KD，表明鸭肝过氧化氢酶由4条相同的多肽链组成。3.3 过氧化氢酶的最适pH与pH稳定性实验结果表明,鸡肝过氧化氢酶在pH 7.0左右时活性最强,pH 5.07.5活力较高,超出其范围活力较低(图4)。鸡肝过氧化氢酶在pH 38的范围内是比较稳定的,在pH 58的范围内活性基本保留原有活性的90%以上,pH 9.0时,残余酶活力不到60%(图5)。

15、图4. PH对鸡肝过氧化氢酶活力的影响图5.鸡肝过氧化氢酶的PH稳定性3.4 过氧化氢酶的最适温度与热稳定性实验结果表明,鸡肝过氧化氢酶的最适温度为40左右(图6),2040具有较好的热稳定性,保温60min活性保留原有活性的90%以上。该酶60保温60min活性丧失50%以上,65保温10min活性损失殆尽(图7)。图6.温度对鸡肝过氧化氢酶活力的影响图7.鸡肝过氧化氢酶温度稳定性3.5 酶促反应初速度V0的测定过氧化氢酶催化过氧化氢的反应初速度的测定结果见图8,得出回归方程:y=46.111x+70.713,可求出其反应初速度V0为373.60mol/(L·min)。图8.酶促反

16、应初速度3.6 米氏常数Ks以及Vm的测定在最适条件下,测定底物浓度为4.69,9.38,14.06,18.75,28.13,37.50 mmol/L的反应速度,按测定结果计算1/S和1/V,并按双倒数法作图,得到线性回归方程:y=5.9853x+0.1606,求得过氧化氢酶的Km值为37.29mmol/L(图9)。图9. 过氧化氢酶米氏常数Km及Vm的测定3.7 金属离子对鸡肝过氧化氢酶活性的影响金属离子对鸡肝过氧化氢酶活性的影响结果见表2，表中可见Ba2+,As3+,K+,Cr3+对酶活性影响不大,Cu2+,Mn2+极大的降低了酶的活性,Pb2+,Ag+,Fe2+使酶完全丧失了活性,而Mg

17、2+对酶却有微弱的激活作用。表2.金属离子对鸡肝过氧化氢酶活性的影响金属离子名称金属离子浓度金属离子名称金属离子浓度1mmol/L相对酶活力1mmol/L相对酶活力Ba2+97.2Cu2+19.7As3+81.9Ag+0.0Cr3+75.2Fe2+0.0K+87.8Pb2+0.0Mn2+20.6Mg2+105.73.8. 部分化学试剂对鸡肝过氧化氢酶的影响部分化学试剂对鸡肝过氧化氢酶的影响见表3。实验结果表明,EDTA、尿素对过氧化氢酶影响不大;抗坏血酸对过氧化氢酶酶活力有较强的抑制作用。表3.部分化学试剂对鸡肝过氧化氢酶的影响化学试剂浓度/(mmol·L-1)相对酶活力抗环血酸0.

18、131.90.215.80.415.0EDTA5.096.310.088.715.084.4尿素5.098110.091.715.08684. 讨论本研究通过匀浆、磷酸缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析及Sephacryl S-200凝胶过滤层析，从鸡肝中分离纯化出电泳纯的过氧化氢酶，回收率为18.23%，比活达4780.38U/mg，纯化倍数为66.15。在DEAE-Sepharose离子交换层析过程中，有总活力上升的情况出现,这可能是因为过氧化氢酶原被激活而引起的。王永权等人以牛血为材料，纯化其中的过氧化氢酶10，回收率为29.6%，比活高达65 918

19、U/mg，大大提高与本实验的最后结果，这是因为王永权等人在纯化过程中加入聚乙二醇600作为层析伴侣，而PEG很可能稳定了过氧化氢酶分子的四聚体结构，从而有效提高了比活和回收率。该酶最适pH为7，与贻贝过氧化氢酶9、重组大肠杆菌过氧化氢酶23的最适pH一致，与蚯蚓24以及苹果12的过氧化氢酶有一定差异。该酶最适温度为40 ，2040的热稳定性较好，保温60min活性保留原有活性的90%以上，该酶60保温60min活性丧失50%以上，65保温10min活性损失殆尽；而贻贝、苹果的过氧化氢酶的最适温度分别为：35、50且对热很不稳定9,12。这说明不同种属之间的过氧化氢酶在性质上是有一定差异的。该酶

20、的Km为37.29mmol/L，而蚯蚓、苹果过氧化氢酶的Km为143mmol/L和2.27mmol/L，这说明鸡肝过氧化氢酶对底物的亲和力要大大高于蚯蚓过氧化氢酶，但不及苹果中的过氧化氢酶。4. 致谢 感谢邓老师给我这次独立完成实验的机会。让我在这次实验中锻炼了自己独立思考问题和解决问题的能力。让我体会了做科研的困难和艰苦。同时也感谢这次实验帮助我的同学。参考文献:1刘昌玲,王国庆.细菌过氧化氢酶的分离、结晶及性质J.生物化学与生物物理进展,1900,17(5):380-383.2黄永洪,花慧,沈国强,等.猪肝过氧化氢酶提取条件的研究J.生物技术通讯,2005,16(1):40-42.3Aeb

21、iH.HetergeneityofErythroeyteCatalase2J.EurJBiochem,1974,48,137.4BonaventuraJ.HumanErythrocyteCatalaseJ.ArchBiochemBiophys,1972,148:505.5MurthyM.StructureofBeefLiverCatalase J.J Mol Biol,1981,152:465.6陆中庆,季钟煌.从牛肝中提取过氧化氢酶工艺探讨J.生化药物杂志,1989,(1):30.7张尔贤,吴丹奇,俞丽君,等.猪血过氧化氢酶的纯化及其某些性质研究J.药物生物技术,1994,1(2):5.8汪开治,编译.人胎盘提纯过氧化氢酶J.生物技术通报,1999,5:6.9林少琴,兰瑞芳,余萍,等.贻贝过氧化氢酶的纯化及部分性质J.食品科学,2000,21(11):22-24.10王永权,路秀玲,苏志国.以聚乙二醇为层析伴侣同时制备SOD、过氧化氢酶和血红蛋白J.生物工程学报,2005,21(3):472-465.11刘冰,梁婵娟.生物过氧化氢酶研究进展J.中国农学通报,2005,21(5):223-225.12邓向军,余筱洁.苹果过氧化氢酶的纯化及性质研究J.食品科技,2006,11:66-68.13周一,严自正,张树正.嗜热链霉菌过氧化氢酶的