实验巨噬细胞酸性磷酸酶显ppt课件

1、实验八、巨噬细胞酸性磷酸酶显示组织化学histochemistry和细胞化学cytochemistryn是在组织切片上或被检资料上，加一定试剂，使它与组织或细胞中待检物质发生化学反响成为有色沉淀物，以用光镜察看，假设为重金属沉淀，可以用电镜察看，称电镜组织化学electron microscope histochemistry)。这种方法可用于检测细胞内的酶类、糖类、脂类、核酸与某些金属元素等。如进一步运用显微分光光度计等测定标本中沉淀物的强度，那么能较准确地进展定量研讨。1. 糖类显示法n最常用的显示方法是过碘酸-雪夫反响periodic acid Schiff，PAS反响)。n根本原理是：

2、糖被强氧化剂过碘酸HIO4)氧化后，构成2-醛基；后者与Schiff试剂中的无色品红亚硫酸复合物结合，构成紫红色反响产物,PAS反响阳性部位即表示多糖的存在。2. 酶类显示 n酶的显示法是经过显示酶的活性来阐明酶的存在，而不是酶的本身。n将具有酶活性的组织放人含有一定底物的溶液中孵育，底物经酶的作用构成初级反响产物，它再与某种捕捉剂相反响，构成显微镜下可视性沉淀，即最终反响产物。3脂类显示 n脂类物质包括脂肪与类脂。n标本可用甲醛固定、冷冻切片、用油红、苏丹、苏丹、苏丹黑B、尼罗蓝等脂溶性染料染色；亦可用锇酸固定兼染色，脂类呈黑色。 4核酸显示法n显示DNA的传统方法为Feulgen反响。n切

3、片DNA经弱酸(1mol/LHcl)水解,其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键翻开,使脱氧核糖的一端构成游离的醛基,这些醛基在原位与Schiff试剂(无色品红亚硫酸钠溶液)反响,构成紫红色的化合物,使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反响.紫红色的产生,是由于反响产物的分子内含有醌基,醌基是发色团,因此具有颜色. n如用甲基绿-派假设宁反响，可同时显示细胞内的DNA和RNA。n甲基绿与细胞核中的DNA结合呈蓝绿色，派假设宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红色。 酸性磷酸酶显示实验原理 n酸性磷酸酶能分解磷酸脂常用-甘油磷酸钠而释放出磷酸基。在pH50的环境中，磷酸基能与铅盐硝酸铅，捕捉剂反响构成无色的磷

4、酸铅微细沉淀，可在电镜下察看，再经过与硫化铵作用，构成棕黑色的硫化铅沉淀可在光镜下察看，以此显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。 实验资料： n小鼠腹腔液涂片重点察看巨噬细胞。实验试剂及用品 1、6淀粉肉汤 牛肉膏 03g 蛋白胨 1.0g 氯化钠 05g 可溶性淀粉 6g 蒸馏水 100ml 高压灭菌99104pa(15磅)20min 2、10中性福尔马林(pH6871) 甲醛 10ml 蒸馏水 90ml 醋酸钠 2g 3、酸性磷酸酶作用液 配方： 蒸馏水 90ml 02molL醋酸缓冲液(pH46) 12ml 5硝酸铅 2ml 3.2甘油磷酸钠 4ml 配法：先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合，随

5、后分成大致相等的两份，一份中加硝酸铅溶液，另一份加甘油磷酸钠溶液，然后再将两者渐渐混合，边混边搅匀。 假设pH不到50，可加少量醋酸的调整。留意：配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀； 最好在临用前配制，不能储存。附：02molL醋酸缓冲液pH46配制方法 0.2mol/l醋酸ml 25.5 0.2mol/l醋酸钠ml24.54、1硫化铵溶液 硫化胺 1ml 蒸馏水 9ml 5、姬姆萨染液1：30 姬姆萨原液 3滴 磷酸盐缓冲液pH68 5ml 实验方法1、巨噬细胞诱导：实验前2天开场，每日向小鼠腹腔注射6淀粉肉汤1ml，延续注射3天。2、搜集巨噬细胞： 在第三天注射后34h，再向腹腔注射生理盐水1ml，过3min后抽取腹腔液。3、粘附：将腹腔液滴在预冷的载玻片上，每人2片，每片23滴，将玻片程度放到冰箱内4，让细胞自行铺展、粘附30min。 将其中1片样品置湿盒内放50温箱中30min，使酶失活4、固定：将玻片插入盛有10中性福尔马林已预冷的染色缸内，冰箱内4固定30min。5、自来水漂洗5min，将水甩干。 6、加足量酸性磷酸酶作用液覆盖样品，放37水浴箱中反响30min。 7、自来水漂洗片刻。 9、在通风橱中加硫化铵反响10min。10、自来水冲洗，甩干。11、直接加PBS封片或用1 30的Giemsa染液染色15min再封片。12、