最新分子荧光分析N

1、第三章第三章 分子荧光分析法分子荧光分析法chapter 3 molecular fluorescence第一节第一节 概述概述一、分子荧光分析法一、分子荧光分析法利用利用物质分子物质分子的的荧光荧光进行分析测定的方法进行分析测定的方法第一节第一节 概述概述一、分子荧光分析法一、分子荧光分析法利用利用物质分子物质分子的的荧光荧光进行分析测定的方法进行分析测定的方法化合物分子化合物分子吸收吸收电磁波电磁波并并发射出发射出另一波长电磁波另一波长电磁波二、分子荧光与荧光量子效二、分子荧光与荧光量子效(产产)率率1. 分子荧光分子荧光2. 荧光量子效荧光量子效(产产)率率 荧光分子发射与吸收的光量子数

2、之比荧光分子发射与吸收的光量子数之比)()(affii吸收的光强度荧光强度吸收的光量子数发射的光量子数l lex、i0l lem、if定性定性定量定量激发光激发光发射光发射光第一节第一节 概述概述一、分子荧光分析法一、分子荧光分析法二、分子荧光与荧光量子效二、分子荧光与荧光量子效(产产)率率affii /利用利用物质分子物质分子的的荧光荧光进行分析测定的方法进行分析测定的方法三三、溶液的、溶液的荧光强度荧光强度kclciiff03 . 2荧光定量分析基本关系式荧光定量分析基本关系式荧光溶液的吸光度荧光溶液的吸光度0.05该关系式是如何得来的？该关系式是如何得来的？affii /affiicli

3、iat0log)1 (3 . 200cltaeiiiiclclteiii3 .20010)1 (3 . 20clffeii ! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(3 . 21323 . 2clclcleclclecl3 . 213 . 2若若05.0lckclciiff03 . 2第一节第一节 概述概述一、分子荧光分析法一、分子荧光分析法二、分子荧光与荧光量子效二、分子荧光与荧光量子效(产产)率率affii /利用利用物质分子物质分子的的荧光荧光进行分析测定的方法进行分析测定的方法三三、溶液的、溶液的荧光强度荧光强度kclciiff03 . 2荧光定量分析基本关系式荧光定量分析基本关系式荧光

4、溶液的吸光度荧光溶液的吸光度0.05四四、溶液、溶液荧光的猝灭荧光的猝灭荧光物质分子其它物质分子相互作用引起荧光强度降低的现象荧光物质分子其它物质分子相互作用引起荧光强度降低的现象荧光猝灭法荧光猝灭法第二节第二节 荧光光谱仪荧光光谱仪第二节第二节 荧光光谱仪荧光光谱仪一一、荧光光谱仪的基本结构荧光光谱仪的基本结构发射光发射光单色器单色器样品池样品池激发光激发光单色器单色器光源光源i0透射光透射光检测器检测器信号显示系统信号显示系统fit狭缝狭缝第二节第二节 荧光光谱仪荧光光谱仪一一、荧光光谱仪的基本结构荧光光谱仪的基本结构二二、荧光光谱仪的主要部件荧光光谱仪的主要部件1. 光源光源为荧光测定提

5、供为荧光测定提供足够强度的足够强度的、稳定的稳定的激发光激发光氙灯氙灯、高压汞灯、激光器、高压汞灯、激光器发射光发射光单色器单色器样品池样品池激发光激发光单色器单色器光源光源检测器检测器第二节第二节 荧光光谱仪荧光光谱仪一一、荧光光谱仪的基本结构荧光光谱仪的基本结构二二、荧光光谱仪的主要部件荧光光谱仪的主要部件1. 光源光源氙灯、高压汞灯、激光器氙灯、高压汞灯、激光器2. 激发单色器激发单色器将光源发出的复合光分解为单色光将光源发出的复合光分解为单色光干涉滤光片、干涉滤光片、光栅光栅发射光发射光单色器单色器样品池样品池激发光激发光单色器单色器光源光源检测器检测器第二节第二节 荧光光谱仪荧光光谱

6、仪一一、荧光光谱仪的基本结构荧光光谱仪的基本结构二二、荧光光谱仪的主要部件荧光光谱仪的主要部件1. 光源光源氙灯、高压汞灯、激光器氙灯、高压汞灯、激光器2. 激发单色器激发单色器干涉滤光片、光栅干涉滤光片、光栅熔融石英熔融石英盛放试样的容器盛放试样的容器不吸光、无荧光、四壁透明不吸光、无荧光、四壁透明3. 吸收池吸收池发射光发射光单色器单色器样品池样品池激发光激发光单色器单色器光源光源检测器检测器第二节第二节 荧光光谱仪荧光光谱仪一一、荧光光谱仪的基本结构荧光光谱仪的基本结构二二、荧光光谱仪的主要部件荧光光谱仪的主要部件1. 光源光源氙灯、高压汞灯、激光器氙灯、高压汞灯、激光器2. 激发单色器

7、激发单色器干涉滤光片、光栅干涉滤光片、光栅熔融石英熔融石英四壁透明四壁透明3. 吸收池吸收池将荧光物质产生的荧光分解为单色光将荧光物质产生的荧光分解为单色光4. 发射单色器发射单色器光栅光栅发射光发射光单色器单色器样品池样品池激发光激发光单色器单色器光源光源检测器检测器第二节第二节 荧光光谱仪荧光光谱仪一一、荧光光谱仪的基本结构荧光光谱仪的基本结构二二、荧光光谱仪的主要部件荧光光谱仪的主要部件1. 光源光源氙灯、高压汞灯、激光器氙灯、高压汞灯、激光器2. 激发单色器激发单色器干涉滤光片、光栅干涉滤光片、光栅熔融石英熔融石英四壁透明四壁透明3. 吸收池吸收池4. 发射单色器发射单色器光栅光栅将荧

8、光信号转换为电学信号将荧光信号转换为电学信号光电管、光电管、光电倍增管光电倍增管、ccd、二极管阵列、光子计数器、二极管阵列、光子计数器5. 检测器检测器灵敏度高灵敏度高发射光发射光单色器单色器样品池样品池激发光激发光单色器单色器光源光源检测器检测器第二节第二节 荧光光谱仪荧光光谱仪一一、荧光光谱仪的基本结构荧光光谱仪的基本结构二二、荧光光谱仪的主要部件荧光光谱仪的主要部件三三、激发光选择与、激发光选择与激发光谱激发光谱激发光谱：荧光强度与激发光波长间的关系曲线。激发光谱：荧光强度与激发光波长间的关系曲线。激发光波长：激发光波长： 最大激发波长最大激发波长 l lex与紫外吸收光谱一致与紫外吸

9、收光谱一致发射光发射光单色器单色器样品池样品池激发光激发光单色器单色器光源光源检测器检测器第二节第二节 荧光光谱仪荧光光谱仪一一、荧光光谱仪的基本结构荧光光谱仪的基本结构二二、荧光光谱仪的主要部件荧光光谱仪的主要部件三三、激发光选择与、激发光选择与激发光谱激发光谱最大激发波长最大激发波长 l lex四四、发射光选择与发射、发射光选择与发射光谱光谱发射光谱：荧光强度与发射光波长间的关系曲线。发射光谱：荧光强度与发射光波长间的关系曲线。与激发光波长无关与激发光波长无关发射光波长：发射光波长： 最大发射波长最大发射波长 l lemstokes位移位移镜像规则镜像规则发射光发射光单色器单色器样品池样品

10、池激发光激发光单色器单色器光源光源检测器检测器第三节第三节 分子荧光分析法的应用分子荧光分析法的应用二二、荧光定性分析荧光定性分析很少采用很少采用利用荧光激发和发射光谱实现利用荧光激发和发射光谱实现三三、荧光定量分析荧光定量分析标准曲线法标准曲线法与紫外与紫外-可见分光光度法相同可见分光光度法相同kcif标准对比法标准对比法a0.05定量依据定量依据定量方法定量方法一一、荧光分析法的特点荧光分析法的特点1. 灵敏度高灵敏度高(1100ppb)暗背景下测量暗背景下测量2. 选择性好选择性好3. 提供的物理参数较多提供的物理参数较多4. 方法简便、试样用量少方法简便、试样用量少第四节第四节 分子荧

11、光的产生分子荧光的产生一一、分子发光与分子荧光分子发光与分子荧光激发能量激发能量激发激发定性定性l li i样品样品样品样品发射发射定量定量激发能量激发能量电磁波电磁波化学能化学能生物能生物能分子发光分子发光荧光、磷光荧光、磷光化学发光化学发光生物发光生物发光分子发光分析的特点分子发光分析的特点灵敏度高、选择性好灵敏度高、选择性好光致发光光致发光化合物分子化合物分子吸收能量吸收能量从基态电子能级从基态电子能级跃迁跃迁至激发态，若其返回至激发态，若其返回基态时基态时释放出电磁辐射释放出电磁辐射，则产生分子发光。，则产生分子发光。第四节第四节 分子荧光的产生分子荧光的产生一一、分子发光与分子荧光分

12、子发光与分子荧光二二、荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生1. 分子的激发分子的激发基态基态激发态激发态激发激发 单重态单重态激发激发 三重态三重态第四节第四节 分子荧光的产生分子荧光的产生一一、分子发光与分子荧光分子发光与分子荧光二二、荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生激发单重态、激发三重态激发单重态、激发三重态1. 分子的激发分子的激发2. 激发态分子的去活化激发态分子的去活化a. 振动驰豫振动驰豫激发激发 单重态单重态激发激发 三重态三重态激发态分子将过剩的激发态分子将过剩的振动能振动能量量以以热热的形式传递给周围分的形式传递给周围分子，从而失活到该电子能级子，从而失活到该电子能级的较低振动能

13、层。的较低振动能层。第四节第四节 分子荧光的产生分子荧光的产生一一、分子发光与分子荧光分子发光与分子荧光二二、荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生1. 分子的激发分子的激发2. 激发态分子的去活化激发态分子的去活化a. 振动驰豫振动驰豫b. 内转换内转换激发态分子通过振动能层间激发态分子通过振动能层间的重叠由的重叠由较高电子能级较高电子能级失活失活到到较低电子能级的较高振动较低电子能级的较高振动能层能层。激发激发 单重态单重态激发激发 三重态三重态激发单重态、激发三重态激发单重态、激发三重态第四节第四节 分子荧光的产生分子荧光的产生一一、分子发光与分子荧光分子发光与分子荧光二二、荧光和磷光的产生荧

14、光和磷光的产生1. 分子的激发分子的激发2. 激发态分子的去活化激发态分子的去活化a. 振动驰豫振动驰豫b. 内转换内转换激发激发 单重态单重态激发激发 三重态三重态处于处于第一单重激发态最低振第一单重激发态最低振动能层动能层的荧光分子，的荧光分子，发射光发射光子子返回基态的过程。返回基态的过程。c. 荧光发射荧光发射激发单重态、激发三重态激发单重态、激发三重态第四节第四节 分子荧光的产生分子荧光的产生一一、分子发光与分子荧光分子发光与分子荧光二二、荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生1. 分子的激发分子的激发2. 激发态分子的去活化激发态分子的去活化a. 振动驰豫振动驰豫b. 内转换内转换两个电

15、子能态的振动能层间两个电子能态的振动能层间有较大重叠时，有较大重叠时，不同多重态不同多重态间的转换间的转换。激发激发 单重态单重态激发激发 三重态三重态处于处于第一单重激发态最低振动能层第一单重激发态最低振动能层的荧光分子，的荧光分子，发射光子发射光子返回基返回基态的过程。态的过程。d. 系间跨越与磷光发射系间跨越与磷光发射c. 荧光发射荧光发射荧光与磷光的判断：激发光去除后，荧光立即消失，磷光不会立荧光与磷光的判断：激发光去除后，荧光立即消失，磷光不会立即消失。即消失。激发单重态、激发三重态激发单重态、激发三重态第四节第四节 分子荧光的产生分子荧光的产生一一、分子发光与分子荧光分子发光与分子

16、荧光二二、荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生光致激发，发射电磁波光致激发，发射电磁波三三、荧光和分子结构的关系荧光和分子结构的关系分子必须能够吸收激发光分子必须能够吸收激发光分子必须具有一定的荧光量子产率分子必须具有一定的荧光量子产率)()(affii吸收的光强度荧光强度吸收的光量子数发射的光量子数与激发态分子失活过程的速率常数有关与激发态分子失活过程的速率常数有关ifffkkk1. 分子荧光产生的必备条件分子荧光产生的必备条件第四节第四节 分子荧光的产生分子荧光的产生一一、分子发光与分子荧光分子发光与分子荧光二二、荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生光致激发，发射电磁波光致激发，发射电磁波三三、荧

17、光和分子结构的关系荧光和分子结构的关系1. 分子荧光产生的必备条件分子荧光产生的必备条件吸光，一定的荧光量子产率吸光，一定的荧光量子产率a. 跃迁类型跃迁类型p pp p*跃迁荧光效率较高。跃迁荧光效率较高。b. 共轭效应共轭效应共轭体系越大、共轭程度越高，荧光越强。共轭体系越大、共轭程度越高，荧光越强。0.070.180.930.272. 分子荧光与分子结构的关系分子荧光与分子结构的关系第四节第四节 分子荧光的产生分子荧光的产生一一、分子发光与分子荧光分子发光与分子荧光二二、荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生光致激发，发射电磁波光致激发，发射电磁波三三、荧光和分子结构的关系荧光和分子结构的关系

18、1. 分子荧光产生的必备条件分子荧光产生的必备条件吸光，一定的荧光量子产率吸光，一定的荧光量子产率a. 跃迁类型跃迁类型p pp p*跃迁荧光效率较高。跃迁荧光效率较高。b. 共轭效应共轭效应共轭体系越大、共轭程度越高，荧光越强。共轭体系越大、共轭程度越高，荧光越强。2. 分子荧光与分子结构的关系分子荧光与分子结构的关系c. 刚性平面结构刚性平面结构0.181第四节第四节 分子荧光的产生分子荧光的产生一一、分子发光与分子荧光分子发光与分子荧光二二、荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生光致激发，发射电磁波光致激发，发射电磁波三三、荧光和分子结构的关系荧光和分子结构的关系1. 分子荧光产生的必备条件分

19、子荧光产生的必备条件吸光，一定的荧光量子产率吸光，一定的荧光量子产率a. 跃迁类型跃迁类型p pp p*跃迁荧光效率较高。跃迁荧光效率较高。b. 共轭效应共轭效应共轭体系越大、共轭程度越高，荧光越强。共轭体系越大、共轭程度越高，荧光越强。2. 分子荧光与分子结构的关系分子荧光与分子结构的关系c. 刚性平面结构刚性平面结构供电子基团供电子基团：增强；：增强；吸电子基团吸电子基团：减弱。：减弱。重原子效应重原子效应：荧光减弱、磷光增强。：荧光减弱、磷光增强。d. 取代基效应取代基效应fclbri0.160.050.010第四节第四节 分子荧光的产生分子荧光的产生一一、分子发光与分子荧光分子发光与分

20、子荧光二二、荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生光致激发，发射电磁波光致激发，发射电磁波三三、荧光和分子结构的关系荧光和分子结构的关系p pp p*，共轭，刚性结构，取代基，共轭，刚性结构，取代基四四、影响溶液、影响溶液荧光强度的因素荧光强度的因素一般溶剂效应一般溶剂效应特殊溶剂效应特殊溶剂效应介电常数、折射率介电常数、折射率溶剂与荧光物质间的特殊作用溶剂与荧光物质间的特殊作用1. 溶剂影响溶剂影响2. 温度影响温度影响温度升高，荧光减弱温度升高，荧光减弱3. ph影响影响改变含有酸碱官能团分子的结构改变含有酸碱官能团分子的结构4. 内滤光作用与自吸现象内滤光作用与自吸现象干扰物质和溶液浓度干扰物

21、质和溶液浓度5. 散射光的影响散射光的影响nh2nh3h+oh-第四节第四节 荧光分析新技术简介荧光分析新技术简介什么是分子荧光？（分子发光与分子荧光的定义）什么是分子荧光？（分子发光与分子荧光的定义）分子荧光是如何产生的？（分子发光的基本原理）分子荧光是如何产生的？（分子发光的基本原理）分子荧光是如何测量的？（荧光光度计、激发光谱、发射光谱）分子荧光是如何测量的？（荧光光度计、激发光谱、发射光谱）什么物质可产生分子荧光？什么物质可产生分子荧光？什么因素影响化合物的荧光强度？什么因素影响化合物的荧光强度？分子荧光法如何进行定性和定量分析？分子荧光法如何进行定性和定量分析？一、什么是分子发光？分子发光有哪几类？一、什么是分子发光？分子发光有哪几类？二、分子荧光或磷光