理论3：聚合酶链式反应(PCR)及引物设计

1、 2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班主讲人：刘彩云主讲人：刘彩云 理论三：聚合酶链式反应理论三：聚合酶链式反应(PCR)及引物设计及引物设计2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班p 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR） 的技术原理的技术原理及实验操作及实验操作p PCR引物设计软件的使用（引物设计软件的使用（ Primer Premier 5.0 ）C2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班聚合酶链式反应（PCR） 实验目的实验目的1 实验原理（实验原理（PCRPCR及引物设计）及引物设

2、计）2 实验仪器、试剂及耗材实验仪器、试剂及耗材3 实验步骤实验步骤4 实验结果及讨论实验结果及讨论2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班实验目的v 了解了解PCR的基本原理的基本原理v 掌握掌握PCR的基本操作技术的基本操作技术 v 学习引物设计的原则及引物设计软件学习引物设计的原则及引物设计软件Primer5的使用的使用2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班聚合酶链式反应（PCR） 实验目的实验目的1 实验原理（实验原理（PCRPCR及引物设计）及引物设计）2 实验仪器、试剂及耗材实验仪器、试剂及耗材3 实验步骤实验步骤4

3、 实验结果及讨论实验结果及讨论2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班实验原理 PCRPCR技术原理技术原理 引物设计的原则引物设计的原则 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反应体系反应体系 PCRPCR反应条件优化反应条件优化 PCRPCR的应用的应用2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班PCR技术原理v 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。v PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，

4、还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。 2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班PCR技术原理 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班PCR技术原理模板与引物的复性,引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。Tm-5Tm-5C C在

5、加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA9494C C从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，按53的方向沿着模板顺序合成新的DNA链7272C C变性变性退火退火延伸延伸2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班PCR技术原理2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班 PCR出现的问题： PCR扩增未得到目的条带？ 扩增出目的条带之外的多条带（非特异性）？ 扩增的目的条带很弱？引物是否合引物是否合适适? ?引物设计是引物设计是PCR 技术中至关重要的一环技术中至关重要的一环2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全

6、国分子细胞生物学实验技术培训班实验原理 PCRPCR技术原理技术原理 引物设计的原则引物设计的原则 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反应体系反应体系 PCRPCR反应条件优化反应条件优化 PCRPCR的应用的应用2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班引物设计的原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 基本原则：基本原则：2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班引物设计的原则一般原则：一般原则：1. 引物的长度：配对引物的

7、长度一般在15-30bp之间比较合适。v 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5） vTm值的计算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 2. 引物的GC%含量：一般为40%-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班引物设计的原则3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。4. 引物3端的末位碱基避开密码子的第3位，且最好不选择A5. 引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。 2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班引

8、物设计的原则6. 引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构； 引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体； 2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班实验原理 PCRPCR技术原理技术原理 引物设计的原则引物设计的原则 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反应体系反应体系 PCRPCR反应条件优化反应条件优化 PCRPCR的应用的应用2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班1. 缓冲液： 10 50 mM Tris- Cl (pH8.4) 维持 Taq 酶作用环境 25 50 mM KCl 促进引物退火 10

9、0g / ml 牛血清白蛋白 (BSA) 对酶有一定的保护性 0.5 2.5 mM MgCl2 Taq 酶具有 Mg2+依赖性2. dNTPs : dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP底物 0.5 2.5 M PCR的成分和作用2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班 3. 引物 (Primer-P)： 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。 0.1 1 M 4. 模板DNA (Template): 最低102 105 DNA片段，实际用量远远超过此量，用量需在实验中摸索。1 5 lPCR的成分和作用2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞

10、生物学实验技术培训班5. Taq DNA 聚合酶 耐高热 0.5 5 U / 100 l 1U / 25 50l6. 水： 去离子水，补足整个反应体积。PCR的成分和作用2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班实验原理 PCRPCR技术原理技术原理 引物设计的原则引物设计的原则 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反应体系反应体系 PCRPCR反应条件优化反应条件优化 PCRPCR的应用的应用2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班常用30l 各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行

11、核算。PCR反应体系2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班 操作： 5份标本 总体积 30l 6 = 180l 1. 取一 0.5 ml Ep 管，加入下列试剂： 10buffer： 3l 6 = 18l dNTPs: 1.0l6 = 6.0l 引物P1： 1.0l 6 = 6.0l 引物P2： 1.0l 6 = 6.0l Taq 酶 (5U/l)： 0.2l 6 = 1.2l 水： 22.8l 6 = 136.8l 共174l，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时 混匀（管壁上液体沉至管底）。PCR反应体系冰上操作！冰上操作！2014全国分子细胞生物学实

12、验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班2. 另取 5 支0.2ml PCR管，分别加入上述液体29l。3. 分别取标本模板各1l，加入上述5支PCR 管中，混匀，离心机瞬时离心，备用。4. 反应条件：PCR扩增仪 PCR反应体系 945 945 94 3094 30 55 30 55 30 72 72 453030个循环个循环 72 572 2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班实验原理 PCRPCR技术原理技术原理 引物设计的原则引物设计的原则 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反应体系反应体系 PCRPCR反应条件优化反应条件优化 P

13、CRPCR的应用的应用2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班 变性温度和时间：变性温度和时间： 保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。 加热9095，30 60 s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94 30 ，可使各种复杂的DNA分子完全变性。 PCR反应条件优化2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班 退火温度和时间：退火温度和时间： PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。 退火温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，一般位于

14、40 60，30 60 s。 退火温度越高，产物特异性越高。退火温度越低，产物特异性越低。 设置退火温度梯度，摸索最佳退火温度！设置退火温度梯度，摸索最佳退火温度！ PCR反应条件优化2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班 延伸温度和时间：延伸温度和时间： 延伸温度一般位于Taq酶最适作用温度70 75 之间，常用72 延伸时间，可根据待扩增片段的长度和使用的Taq酶而定，一般taq酶的扩增效率是1kb/1min 延伸时间过长可出现非特异扩增。 PCR反应条件优化2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班 循环数：循环数： 其他参

15、数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。 理论上说20 25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20 30次是比较合理的循环次数。 循环次数越多，非特异扩增增加。PCR反应条件优化2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班实验原理 PCRPCR技术原理技术原理 引物设计的原则引物设计的原则 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反应体系反应体系 PCRPCR反应条件优化反应条件优化 PCRPCR的应用的应用2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学

16、实验技术培训班1、目的基因的克隆：、目的基因的克隆： PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。 2、基因的体外突变：、基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR的应用2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班3、DNA和和RNA的微量分析：的微量分析： PCR技术高度敏感，对模板的含量要求很低，是DNA和NA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。4、基因转录水平检测、基因转录水平检测 RT-PCR可检测

17、不同组织或细胞中基因的转录水平5、基因突变分析：、基因突变分析：利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。PCR的应用2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班聚合酶链式反应（PCR） 实验目的实验目的1 实验原理（实验原理（PCRPCR及引物设计）及引物设计）2 实验仪器、试剂及耗材实验仪器、试剂及耗材3 实验步骤实验步骤4 实验结果及讨论实验结果及讨论2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班实验仪器、试剂及耗材v 实验仪器及耗材 PCR仪、移液器、0.2 mL PCR管、各种规格的吸头。2014全国分子细胞生物

18、学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班实验仪器、试剂及耗材v 实验试剂 10PCR buffer (Mg2+ Plus)（YRBIO）； dNTP mix (2.5 mM each) （YRBIO）； Taq DNA Polymerase (2U / L) （YRBIO）； 引物：Tpm4-F/Tpm4-R，引物溶液浓度为10 M； Tpm4基因模板质粒: （购自YRBIO基因库）； 无菌超纯水； 琼脂糖。2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班聚合酶链式反应（PCR） 实验目的实验目的1 实验原理（实验原理（PCRPCR及引物设计）及引物设计）2 实

19、验仪器、试剂及耗材实验仪器、试剂及耗材3 实验步骤实验步骤4 实验结果及讨论实验结果及讨论2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班实验步骤v准备PCR反应溶液，取0.2 mL PCR管，按以下顺序加入各试剂： PCR反应体系 无菌超纯水 38 L 10buffer 5.0 L dNTP mix 2.5 L 引物Tpm4-F 1 L 引物Tpm4-R 1 L 模板（ TS-Tpm4 ） 2 L Taq酶 0.5 L 合计 50 L2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班实验步骤v 调整好反应程序，将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪

20、上，执行扩增。v 反应程序：94 5 min；94 30 sec；55 30 sec；72 45 sec；30个循环，最后72延伸10 min。v 每人做一管，反应完毕后，各取3-5 L进行琼脂糖凝胶（1.0%）电泳检测。2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班聚合酶链式反应（PCR） 实验目的实验目的1 实验原理（实验原理（PCRPCR及引物设计）及引物设计）2 实验仪器、试剂及耗材实验仪器、试剂及耗材3 实验步骤实验步骤4 实验结果及讨论实验结果及讨论2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班实验结果及讨论PCR 产物琼脂糖检测

21、结果1、PCR产物（5ul样品）2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班1. 1. 无扩增产物无扩增产物 模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适对样品不合适 引物设计不当或者发生降解引物设计不当或者发生降解 退火温度太高退火温度太高2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班2. 2. 非特异性扩增非特异性扩增 引物特异性差引物特异性差 模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高 酶量过多酶量过多 退火温度偏低退火温度偏低 循环次数过多循环次数过多2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实

22、验技术培训班3. 3. 拖尾拖尾产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态 M 1 2模板不纯或降解模板不纯或降解BufferBuffer不合适不合适退火温度偏低退火温度偏低酶量过多酶量过多dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高循环次数过多循环次数过多2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班4. 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)交叉污染交叉污染 对策对策 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；溅出离心管外； 除不能耐高温的物质外，所有试剂器除不能耐高温的物质外，所有

23、试剂器材均高压消毒。离心管及枪头等一次材均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。性使用。 各种试剂先进行分装，低温贮存。各种试剂先进行分装，低温贮存。 设置阳性和阴性对照，重复实验设置阳性和阴性对照，重复实验2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班Contentp 聚合酶链式反应（PCR） 的技术原理及实验操作p PCR引物设计软件的使用（ Primer Premier 5.0 ）2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班常用的引物设计软件v Primer Premier 5.0（自动搜索）*v Oligo 6 （引物评价）*v Ve

24、ctor NTI Suitv Dnasisv Omigav D2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班Primer Premier 5.0 简介主要功能:1、引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA 基元(motif)查找4、同源性分析2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班Primer Premier 5.0使用介绍使用介绍Preimer Premier 启动界面Load 2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班Sequence nameOriginal sequenceUse these tw

25、o button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DNA seq 8种密码子偏好Choose a function 引物设计界面2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班引物设计界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the 2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班引物搜索选项设定引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置范围产物大小范围引物长度2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物2014全国分子细胞生物学实验技术培训班全国分子细胞生物学实验技术培训班引物信息回到