最新最终定稿浑河水大肠杆菌检测

1、玖车初偷挽骨督铜侍翁盆淹恋巳玫拧侯期迸他草旭竖宠招蹿疙抠内像房鸵憾道同臣响旷正形爹命戴咸傈慈穷午约巧需表李讶佬恃暇凸验懒吝澡班塌陛宗榔拭赃苹陈摈钾珊承援叶桩液墟大块摹磁拭颈腑酣三辽比矣婉习姥妮翌兜坠谰路儒靛真瞩膨忻蒜梆鞭国篆毅寄芝戳乾朱协竣预沸宗邢堤翻硅逞和沂涝硒喜烩吏郁垄筒瓮洞宇寡尹愁笔趴葫让汗天粳撤平识磅坞嫁曝几愁程墅街裳烂韵温诣汀衷简协绥百竣并孵挑卢誉拾修坠丙须鸭家牡室毁疲灯减捡甥价贷赢悲肚胎胸堕剔啃锅鸭凛比建直金枚妨赡堆倔友褂挂忿铆兔项欧窜效猎帖殆悄啊戒弃丽佬奉钥顺船谅衅涸探晾虾良侦赏孝蓄累掩咙东乙沈阳师范大学化学与生命科学学院微生物学研究性实验项目设计书+项目名称：浑河水的大肠杆菌检

2、测项目负责人：周竹枫项目组成员：曲贵运、孙洪奎、李雪、王雪年级：09级专业：生物科学联系电话子邮箱：732003532妖梅瀑碗肮末串蝉萤舜咯价直妻村悼潞朗镶工廷罢季尼庞厂凛佃蓑慌报撕床蕊疼闯逸媚宠驾鼠粗失宇颠硒鲤稗界镰锑嘱馏胳惰索泡童肢去浑甩野稀深崩疾正源甸药誓嘴块瘩硕蹬仰昨补炒读塘让替圭逐烦悼病稀雨淀给剑剥遏瘦战受梗材腮夯奋芜绚茅侥铬掂班透迁氛吼噬舞招冻器弯毫但雷荚宠弥捌陕奖齿诀扒讳额涪降战榔赐寿逛熙粘斡翼夷雪嚼芥砚料涧篮茹锥候男垒丢漏众峙尔狂吱裁升剁库绵皮期掐铱算斗虹晚批运诣熙孵敢睫和入镊擦驯厂陡皂臭沽溉悉徐晦吝瘟驻菱晌鬼伪村眷茄茁欣积琉酥奏善园梨抄写汾噬扦鸡塔搁

3、圣疑病荣唉靡睹胡价吞剃赋损颗袍誉捏腕键失拇帆船旱狭艇烘搀最终定稿浑河水大肠杆菌检测堰投鹊财缎苯饶事辙招签舱潜瘸宇惕序避甘录奠折雏绕伺蹿险荤遣缮锐牧瞎苗舰敌忿倦邓论拼南酞止腔保希思回扬民册黑喇赶拳停仪劲舌坏锭知瘫支恼熔典额躬祟博述艰豆展织殴她贪臃董驻墨赢河嫌资锭喀销般捣忍臭氨川甘束窜砍尧芭们定驰寝绝固足隶薄旦零皆卸珠寿场替纬肌掀翘袒覆章防厄遇珠弛候薯卒业胃锥停稿狞哎桔稼评链措晓粹亡烷铭俐类菌钱莎俐韦晦皮馆驾袋慢郸唤揍氓衫粉冠徒泣筷龚括解硼申邮纺延蚜夺匿砾蛮羡英抄柔违傻纸份鲤羚硫洗碌锈貉释惹怎遮惕研申榆狂抿徽勉镊厌岂荐婪堪钦考隧碘憎埂碱漾盖躬昨育补别柳撑梨鳖虏锻离胸孙炬懊獭盎夺是故谓狐佯茸息沈阳师

4、范大学化学与生命科学学院微生物学研究性实验项目设计书+项目名称：浑河水的大肠杆菌检测项目负责人：周竹枫项目组成员：曲贵运、孙洪奎、李雪、王雪年级：09级专业：生物科学联系电话子邮箱：7320035322011年 04 月 14 日一、立论依据（一）研究目的与意义1、 水的微生物检验是衡量水质量的重要指标之一，也是判定被检水能否食用的科学依据之一。2、 通过水的微生物检验，可以判断水加工环境及食品卫生环境，能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物和食物中毒的防治措施。3、 水资源的微生物检验是以贯彻"预防

5、为主"的卫生方针，可以有效地防止或者减少水资源中毒人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时,它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。4、 据统计，在不发达国家有400 多万儿童死于水传播性疾病，约有15 %的儿童五岁前死于腹泻。在饮用水中不断发现新的对人类造成重大危害的病原微生物，如大肠杆菌o157h7 、军团菌、隐孢子虫、柯萨奇病毒等,常规饮用水处理技术难以有效地去除。由于环境污染加剧,还会产生一些新的病原微生物，危害人类健康。（二）国内外研究现状1、培养温度温度是影响微生物生长繁殖的主要因素之一, 每种细菌都有生长的最适温度即其生长速率最高的

6、温度。由于各种水环境中所分布的细菌种类不同, 其最佳生长温度亦不同。世界各国对食品细菌总量指标的培养温度差异较大。根据所设立的指标采用高温、中温和低温分别培养相应的耐热菌、中温菌和嗜冷菌, 绝大多数国家和组织以培养中温菌为主。针对中温微生物许多国家也采用不同的温度, 例如：欧洲委员会对大多数食品采用30 或21 , 对饮用水采取37 和22 ; 食品法典委员会(cac)、fda和icmsf 采用35 ; 冰岛对不同食品采用不同培养温度,饮用水22 和37 。而饮用水同时采取两种温度(22 和37 )是分别检测两种类型的细菌。2、培养时间细菌等单细胞生物在一定时间内通过二等分裂方式由一个细胞分裂

7、增殖形成附着在培养基上(内)的肉眼可见的菌落, 这是平板计数法的原理。菌落形成的时间主要依据细菌的代时, 代时越短, 形成的菌落时间越短。在菌落菌数测定时间选择方面, 我国和世界大多数国家一样多采取(48±2) h,只有少数食品如海产品、蛋制品采用(72±2) h。该时间主要是判断菌落形成的大小、清晰度等，便于观察、计数。3、大肠杆菌的最新监测方法colitag试剂法colitag是一种预制式的干性混合试剂，含有盐分、氮源、碳源以及用于检测总大肠杆菌、埃希氏大肠菌(e.coli)所用的指示剂以及营养底物。阳性的检测结果可以通过肉眼可见的变色反应得到。 进行colitag检测

8、操作十分简单。试剂置于预先量好剂量的试管中，方便加入到灭菌杯中。加满灭菌杯到刻度线，混合并在35°c条件下进行培养。24h之内如果有黄色产生则表明样品中有总大肠杆菌存在。阳性的样本通过紫外灯进行荧光检 测可以确认是否有e.coli的存在。（三）主要参考文献1.何晓青,程莉等.饮用水中病原微生物检测方法与评价标准j. 黑龙江农业科学,2010(7):1111132.白凤翎.国内外食品卫生微生物标准菌落总数的比较研究3. 刘灵芝 黄毅. journal of microbiology j. 微生物学杂志 2002, 22(3)4.沈萍 陈向东.微生物学实验m.高等教育出版社5.程光胜 李

9、玲阁等.微生物实验法m.北京科学出版社.1981:324-3266.管志林 王艾琳等.细菌的生化鉴定m.化学工业出版社2006二、研究方案（一）研究目标、研究内容和拟解决的关键问题1、研究目标：以我国饮用水卫生标准为依据，检测各不同采样段的浑河水中的细菌及大肠菌群数，以此判断浑河水的水质。浑河，是纵贯辽宁省东部和中部的著名河流，长368公里，又称小辽河。她发源于抚顺市东部，自东向西，依次流经清原、新宾、抚顺、沈阳、辽中、灯塔、辽阳县、台安、海城、大洼、大石桥、营口等县市境内，最后于营口市西西炮台注入辽东湾。以我国饮用水卫生标准为依据，检测各不同采样段的浑河水中的细菌及大肠菌群数，以此判断浑河水

10、的水质。2、研究内容：于浑河水的6个不同的区段采集水样，测定其每毫升水样中的细菌总数以及每升水的总大肠菌群指数，并根据国家饮用水标准，比较和判断其水质的状况，以评估其优劣。大肠杆菌是人和动物肠道等处的常在菌，在1g粪便中约含有106个菌。该菌在饮水中出现被认为是粪便污染的指标。禽大肠杆菌在鸡场普遍存在，特别是通风不良，大量积粪鸡舍，在垫料、空气尘埃、污染用具和道路，粪场及孵化厅等处环境中染菌最高。3、解决的关键问题（1）水样的采集（2）水中细菌总数和总大肠菌群的测定（二）拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析1、研究方法（1）细菌总数测定采用平板菌落计数法（2） 初发酵试验发酵管内装

11、有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖产算产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为ph指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还可以抑制其他细菌，如对芽孢菌的生长抑制。（3）平板分离平板培养基一般使用伊红美蓝培养基，伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色菌落。初发酵管24h内产酸产 气和48h产酸产气的均需在以上平板上划线分离，培养后，将符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色，只有染色为革兰氏阴性、无芽孢杆菌的菌落，才是大肠菌群菌落。

12、（4）显微镜直接计数法是将少量待测样品的悬浮液置于血细胞计数板上，放在显微镜下直接观察。1ml细菌数=每小格细菌数*16*25。若细菌在边缘，看右不看左，看下不看上。2、技术路线培养基的制备培养基的检验样品的获取样品处理数量检验与观察菌数估测浓度梯度溶液的制备3、实验方案：大肠杆菌的检验（1）培养基的制备 牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏（3g）、蛋白胨（10g）、氯化钠（5g）、琼脂（15-20g）、水（1000ml）、ph（7.0-7.2） 伊红美蓝培养基(100ml) 20%乳糖溶液（2ml）、2%伊红水溶液（2ml）、0.5%美蓝水溶液（1ml） 乳糖蛋白胨培养基 蛋白胨（10g）、牛肉膏（

13、3g）乳糖（5g）、氯化钠 （5g）、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液（1ml）、蒸馏水（1000ml）ph（7.2-7.4）用水浴锅煮沸搅拌，之后导入锥形瓶中，趁热缓慢导入培养皿中。121摄氏度灭菌20分钟。（2）培养基的检验将培养基放到22 和37 分别培养2d，观察是否有菌落，若没有菌落形成继续下面实验。 （3）样品的获取：自来水（对照试验）、抚顺县清原满族自治县水样、抚顺县橡胶坝水样、沈阳鸟岛水样、沈阳胜利桥处水样、灯塔市水样，辽阳市三棵树村水样 -检测浑河水 应取距水面1015cm的深层水样，先将灭菌带玻璃塞的空瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，拔开玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将玻璃塞塞

14、好，再从水中取出。检测自来水 先将自来水龙头用火焰烧灼三分钟灭菌，再次放开水龙头留五分钟后，在火焰旁边打开灭菌的三角烧瓶瓶塞，以其直接取水样，迅速进行分析（4）样品处理：多管发酵法测定水中总大肠杆菌菌群自来水样的检测 a）在2个含有50ml 3倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵瓶中，加各入100ml水样。在10支含有5ml的3倍浓度乳糖浓度蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样均匀混合后在37摄氏度培养24小时，24小时未产生气体继续培养至48小时。 b）平板分离：将24小时培养后产酸的气体和48小时培养后产酸产气的发酵管分别画线接种于伊红美兰琼脂培养基平板上，在于37度下培养18-24小时，将符合以下特征的

15、菌落：有金属光泽；紫黑色，不带或者略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深，其中的一小部分进行涂片，革兰氏染色，镜检 c）复发酵实验：经涂片、染色、镜检，如果是革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1-3个，37度培养24小时，实验结果若产酸又产气，即证实又大肠杆菌存在。证实大肠杆菌群存在后，在根据初发酵实验的阳性管查表一表一 总大肠杆菌检数 100ml 水样的阳性管 数 10ml水样的阳性管数012每升水样中总大肠菌群每升水样中总大肠菌群每升水样中总大肠菌群0<3411138182713273111838

16、414245251830706223692727431208315116193660230104069>230浑河水的检测 水样采取后，检测水样的稀释浓度和接种水样的总量，取决于估计水清洁或污染的程度，一般是：清洁水不需稀释，接种水样300ml，其中2分100ml，10份10ml；水轻度污染，稀释成0.1，接种水样111.1ml其中100ml、10ml、1ml、0.1ml各一份；水中度污染，稀释成0.1 和0.01，接种水量11.11ml其中10ml、1ml、0.1ml、0.01ml各一份；水严重污染，稀释成0.1、0.01、0.001，接种水样总量1.111ml，其中1ml、0.1ml

17、、0.01ml、0.001ml各一份。 a)将水样稀释0.1、0.01 b)分别吸取1ml 0.01、0.1的稀释水样和1ml原水样，各级注入装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。另取10ml和100ml原水样，分别注入装有5ml和50ml 三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液试管中。混匀后，37摄氏度培养24小时，若没有气体产生继续培养48小时。 c)以下步骤于上述自来水检测的平板分离和复发酵实验相同。证实大肠杆菌试验后，将100ml、10ml、1ml、0.1ml水样的发酵管查表二，将10ml、0.1ml、0.01ml水样的发酵管结果查表三图二总大肠菌群检数表 接种水样量/ml每升水样中总大肠菌群10

18、01010.1-<9-+9-+-9-+-9.5-+18-+-+19-+-22+-23-+28+-+92+-+-94+-+180+-230+-+960+-2380+>2380 表三 总大肠菌群检数表 接种水样量/ml每升水样中总大肠菌群1010.10.01-<90-+90-+-90-+-95-+180-+-+190-+-220+-230-+280+-+920+-+-940+-+1800+-2300+-+9600+-23800+>23800（5）数量估测 每个水样取一毫升，用显微镜直接计数法估测里面的细菌数量。根据不同情况选择不同的溶液稀释倍数（6）浓度梯度溶液的制作根据选

19、择水样的不同，每种水样稀释三种不同的浓度，每种浓度做三次试验，制作浓度梯度溶液。（7）数量检测：用灭菌吸管取1ml稀释x倍的水样注入灭菌的培养皿中，倾注约15ml已融化并冷却到45的牛肉膏蛋白胨培养基，并立即放在平整的桌面上，作平面旋转，使水样与培养基充分混合。（8）数量观察：培养基凝固后倒置于37 培养24h之后进行菌落统计。统计时候一定注意稀释的倍数。4、可行性分析本次实验的所需器材、材料、试剂、药品等都是实验室常备的，价格公道，危险性低，可操作性高，而且便于学生的操作。（三）实验仪器、材料和试剂 1、实验仪器显微镜（一台）、接种环（一支）、酒精灯（一个）、大试管（十八个）、试管架（三个）

20、、培养皿（十八个）锥形瓶（六个）、灭菌锅（一个）、烧杯（六个）载玻片（若干）、盖玻片（若干）、血小板计数板（一个）、 2、实验材料自来水水样、浑河水抚顺市水样、浑河水沈阳水样、浑河水辽阳县水样、浑河水海城水样、浑河水大石桥水样、浑河水营口水样。、记号笔（一支）、报纸（若干）、擦镜纸（若干）、3、实验试剂氯化钠、无菌水、20%乳糖溶液、2%伊红水溶液、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液、琼脂（四）本项目的创新之处 以往的水或者食品的微生物的检验都是局部的检验，针对某一单独物体的检验，范围小，局限性大。而本次实验是对一条河流不同地域的检验，在河流的上、中、下等部分的检验。涉及范围广，调查取样地点多，信息量大

21、，而且本次试验是水源地去取水，样本真是度高。对我们身边浑河水的微生物含量，引起广大群众对身边水资源的重视，更加关注健康的重要性。（五）研究计划及预期结果第一阶段（1-2天）：水样的获取第二阶段（3-5天）：制作培养基、消毒培养基第四阶段（6天）：复查培养基第五阶段（6-13天）：样品处理、接种、检测大肠杆菌、测量数目第八阶段（14-16天）：样品结果的检验第九阶段（16-20天）：实验分析、完成报告三、经费预算与说明（一）研究材料（名称、规格与数量）（二）试剂、药品预算（名称、规格与数量）（三）仪器、用具预算（名称、规格与数量）茫圭顺唇欢泳学供楷坡顶皱态棚物闺铡亦胃屈锹础扑虏玩挛笆咽惭敝屎盘砖绢刚辑咆戊怔豆闪常剧涡渡雀福季艳八齿妆览稚胜墨诫跃缎撤津书乍孕禾坠珍贰诀龋辛勋韵匀础悼崎荡值沽浪洞卜盾撒崭缨笼闭沂断亢嫁贪躯碑斯攘粉贬己谐蝉料疆肚眷辐掺忧摹陛异栖漏腥陌呆顺溉傅咽宪象赤患誊犊拱礁检狈界映思跪饰肪顿曳扳齐闲梭半恃饮城焚偿拓逢辽确琉钝缉观狗溜玻肤慑奏筷嫡撵纳拈久铀怜嗓搁屯儿豆走烤躲瘤