第三章发酵液预处理

1、 第三章第三章 发酵液预处理发酵液预处理目的目的n不仅在于分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞不仅在于分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物），碎片、核酸和蛋白质的沉淀物），n还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后继各步操作。以利于后继各步操作。采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降速度；的大小，提高其沉降速度；或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。第一节第一节 发酵液的预处理发酵液的预处理一、发酵液

2、过滤特性的改变一、发酵液过滤特性的改变微生物发酵液的特性为：微生物发酵液的特性为：发酵产物浓度较低，大多为发酵产物浓度较低，大多为1-10%，悬浮液中大部分是水；，悬浮液中大部分是水；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体；液相粘度大，大多为非牛顿型流体； 性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。蛋白酶水解等作用的影响。微生物发酵液的成分极为复杂，其中除了所培养的微生物菌体及残微生物发酵液的成分极为复杂，其中除了所培养的微生物菌体及残存的固

3、体培养基外，还有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋存的固体培养基外，还有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质，以及微生物的各种代谢产物。白质，以及微生物的各种代谢产物。改善发酵液过滤特性的物理化学方法：改善发酵液过滤特性的物理化学方法：调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻加表面活性物质、添加反应剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等。解冻及添加助滤剂等。根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，降低根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，降低液体粘度（加水稀释法和加热法等）

4、可有效提高过滤速率。注意加热液体粘度（加水稀释法和加热法等）可有效提高过滤速率。注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值值可改善其过滤特性。氨基酸、蛋白质等电点的调节；在膜过滤中，发酵可改善其过滤特性。氨基酸、蛋白质等电点的调节；在膜过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值改变易吸附分子的值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染；细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在电

5、荷性质，即可减少堵塞和污染；细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。n凝聚凝聚指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降

6、低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象；作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象；n絮凝絮凝指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。使胶粒形成较大絮凝团的过程。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：Al3+ Fe3+ H+ Ca2+ Mg2+ K+ Na+ Li+常用的凝聚剂电解质有：常用的凝聚剂电解质有：硫酸铝硫酸铝 Al2(SO4)318H2O（明矾）；（明矾）；氯化铝氯化铝 AlCl36H2O;三氯化铁三氯化铁 FeCl3;硫酸亚铁硫酸亚铁 FeSO47H2O ；石灰；石

7、灰；ZnSO4；MgCO3（1）凝聚）凝聚 发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。 l采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。l絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如-

8、COOH）或）或阳离子（如阳离子（如-NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。）基团以及不带电荷的非离子型基团。l它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。吸附在胶粒的表面。l当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮团，这就是表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。絮凝作用。 （2）絮凝）絮凝高分子絮凝剂的吸附和絮凝作用示意图高分子絮凝剂的吸附和絮凝作用示意图1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙

9、）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；烯类衍生物；2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。目前最常见的高分子聚合物絮凝剂目前最常见的高分子聚合物絮凝剂有机合成的聚丙烯酰胺（有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物）类衍生物根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类： 非离子型非离子型 阴离

10、子型（含有羧基）阴离子型（含有羧基）阳离子型（含有胺基）阳离子型（含有胺基）工业上使用的絮凝剂可分为三类：工业上使用的絮凝剂可分为三类：聚丙烯酰胺絮凝剂聚丙烯酰胺絮凝剂聚丙烯酰胺类絮凝剂的聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点优点l 用量少，一般以用量少，一般以mg/L计量；计量；l 絮凝体粗大，分离效果好；絮凝体粗大，分离效果好；l 絮凝速度快；絮凝速度快；l 种类多，适用范围广。种类多，适用范围广。聚丙烯酰胺类絮凝剂的聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点缺点u存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。用于食品和医药工业时应谨慎。聚丙烯酰胺类絮凝剂

11、的聚丙烯酰胺类絮凝剂的应用应用n 医药和食品工业：医药和食品工业：聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯类衍聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯类衍生物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等），天然有生物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等），天然有机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等）。脱乙酰壳多糖等）。影响絮凝的因素絮凝剂的加量絮凝剂的加量( (图图3-13-1）絮凝剂的分子量絮凝剂的分子量溶液的溶液的pHpH搅拌速度搅拌速度搅拌时间搅拌时间n对于带负电荷的菌体或蛋

12、白质来说，采用阳离子型对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理；附桥架的双重机理；n对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。和絮凝机理的过程，称为混凝。一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，改变了

13、滤饼结构，降低了过的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。滤阻力。常用的助滤剂有：常用的助滤剂有： 硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。最常用的是硅藻土。使用硅藻土时，通常细粒用量为使用硅藻土时，通常细粒用量为500 g/m3；中等粒度用量为；中等粒度用量为700 g/m3；粗粒用量为粗粒用量为700-1000 g/m3。加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构

14、，沉淀等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改善过滤性能；本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改善过滤性能；如发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化为单糖，以提高过滤如发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉的淀粉酶，搅拌酶，搅拌30min后，再加后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤效率硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍。倍。 发酵液中的杂质发酵液中的杂质 高价无机离子（高价无机离子（Ca2

15、+、Mg2+、Fe2+） 杂蛋白杂蛋白在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。u在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力u在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清u在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。 因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。二、发酵液的相对纯化二

16、、发酵液的相对纯化（一）、高价无机离子的去除方法（一）、高价无机离子的去除方法 Ca2+ 草酸、草酸、草酸钠草酸钠，形成草酸钙沉淀形成草酸钙沉淀（注（注意回收草酸）意回收草酸） ； Mg2+三聚磷酸钠，三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；溶性络合物； Fe2+ 黄血盐，黄血盐，普鲁士蓝沉淀普鲁士蓝沉淀（二）杂蛋白的去除方法（二）杂蛋白的去除方法蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。l在酸性溶液中带正电荷；在酸性溶液中带正电荷；l在碱性溶液中带负电荷。在碱性溶液中带负电荷。在某一在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。下，净电荷

17、为零，溶解度最小，称为等电点。1. 沉淀法沉淀法l在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；淀；l在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和和Pb2+等形成沉淀。等形成沉淀。酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。2. 变性法变性法 加热加热 大幅度调节大幅度调节pH值值 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。加酒精、丙酮等有机溶剂

18、或表面活性剂等。不足之处不足之处加热法只适合于对热较稳定的目的产物；加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。 在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白

19、质、菌体及其他不溶两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。性粒子吸附并包裹在其中除去。 3. 吸附法吸附法第二节第二节 固液分离工程固液分离工程及设备及设备 重力沉降重力沉降 浮选浮选 旋液分离旋液分离 过滤过滤 离心离心通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。用于固液比重差小、直径用于固液比重差小、直径530m m颗粒的分离，污水处理颗粒的分离，污水处理悬浮液以较高速度沿切线方向进入悬浮液以较高速度沿切线方向进入旋液分离器旋液分离器，轻相由分离器中央排出，轻相由分离器中央排出，重相由分离器下部排出，重相由分离器下部排

20、出，但不适合直径但不适合直径5 m颗粒去除（可用丝网分离器）。颗粒去除（可用丝网分离器）。工业上常用工业上常用霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采用霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采用过滤方法；过滤方法；细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采用高速离心分离，如对发酵液进行预处理，也可用高速离心分离，如对发酵液进行预处理，也可用过滤进行固液分离。用过滤进行固液分离。一、固液分离的方法一、固液分离的方法优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好；优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好；缺点：设备投资高、能耗大。缺点：设备投资高、能耗大。离

21、心机种类：碟片式离心机、管式离心机、倾析式离心机。离心机种类：碟片式离心机、管式离心机、倾析式离心机。1. 离心分离离心分离在液相非均一系统中，利用离心力达到液液、液固、在液相非均一系统中，利用离心力达到液液、液固、液液固分离的方法，统称为离心分离。液液固分离的方法，统称为离心分离。碟片式离心机 是传统离心机，为目前工是传统离心机，为目前工业上应用最广泛的离心机。业上应用最广泛的离心机。分离因数可达分离因数可达1000-200001000-20000，最大处理量达到最大处理量达到300m300m3 3/h/h，常用于大规模的分离过程常用于大规模的分离过程。适用范围 细菌、酵母菌、放线菌、细菌、

22、酵母菌、放线菌、 细胞碎片细胞碎片卸料方式的不同而分类1，人工排渣，人工排渣适用：固相浓度很低，液液分离，同时除去少量固体；澄清作业工业实例：提取抗生素 生产疫苗 收集梭状芽孢杆菌 生物素 生物碱类化合物2，喷嘴排渣，喷嘴排渣 适用：多用于浓缩过程，浓缩比可达5-20 300m3/h 颗粒直径：0.1-100微米 体积浓度: 10%的悬浮液3，活塞排渣，活塞排渣 利用活门启闭排渣孔进行断续自动排渣。位于转鼓底部的环板状活门在操作时可上下移动，位置在上，关闭排渣口，停止卸料。下降时开启排渣口，因此排渣时可以不停机。最大处理能力：40m3/h适合处理直径0.1-500微米，固液密度差大于0.01g

23、/m3，固相含量小于10%的悬浮液。活门排渣碟片离心机是近年新开发的机型， 可使速率增加23%-30%,故可使分离因数达15000左右，这是其他碟片离心机所不能及的。管式离心机 管式离心机是一种分离效率很高的离心管式离心机是一种分离效率很高的离心分离设备，其转鼓细长，可在分离设备，其转鼓细长，可在15000-5000015000-50000的高转速下工作，分离因数可达的高转速下工作，分离因数可达10104 4-6-610105 5。它设备简单、操作稳定。它设备简单、操作稳定。适用范围 细胞、细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、细胞、细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等。特别适合一般分离机难以分离

24、的核酸等。特别适合一般分离机难以分离的固形物含量固形物含量1% 1010）的悬浮）的悬浮液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。和酵母发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。缺点： 由于受真空度的限制，不适于菌体较小和粘度由于受真空度的限制，不适于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤，且过滤所得固相的干较大的细菌发酵液的过滤，且过滤所得固相的干度不如加压过滤。度不如加压过滤。（2）真空转鼓过滤机）真空转鼓过滤机n硅藻土的使用方法：硅藻土的使用方法： 作为过滤介质 预涂在支持介质上 加入到悬浮液中n按支撑单元分：按支撑单元分： 板框过滤机，叶片式过滤机等（3）硅藻土过滤机）硅藻土过滤机1）切向流过滤（）切向流过滤（Cross-Flow Filtration）又称错流过滤）又称错流过滤 交叉过滤和十字流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特交叉过滤和十字流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤