病毒感染的检查方法与防治原则参考PPT

1、1第第2525章章 病毒感染的检查病毒感染的检查方法与防治原则方法与防治原则讲授讲授 陈利玉陈利玉2内内 容容第一节 病毒感染的诊断(检查方法）第二节 病毒感染的特异性预防(自学）第三节 病毒感染的治疗（自学）3（diagnosis of viral infection） 标本采集与送检原则 病毒感染的检查方法4一、标本采集与送检原则一、标本采集与送检原则 按疾病种类与病程采取不同标本按疾病种类与病程采取不同标本 在发病早期与用药之前采取标本在发病早期与用药之前采取标本 无菌操作，无菌操作，有菌标本用有菌标本用“双抗双抗”（青、链霉素）（青、链霉素）或或 “ “三抗三抗”（青、链霉素（青、链霉

2、素+ +两性霉素两性霉素b b）处理）处理 冷藏速送，病变组织用冷藏速送，病变组织用5050甘油保存甘油保存 血清学检测：血清学检测：igm igm 单份血清单份血清, igg , igg 双份血清双份血清 5二、检查方法二、检查方法 病毒的形态学检查病毒的形态学检查 病毒的血清学检查病毒的血清学检查 病毒的分子生物学检查病毒的分子生物学检查 病毒的分离培养与鉴定病毒的分离培养与鉴定61. 1. 病毒形态学检查病毒形态学检查电子显微镜：可观察各种病毒的形态电子显微镜：可观察各种病毒的形态 但设备贵、操作复杂，应用受限但设备贵、操作复杂，应用受限光学显微镜：可观察大病毒（痘病毒光学显微镜：可观察

3、大病毒（痘病毒）和包涵体）和包涵体 对一般病毒检测对一般病毒检测意义不大意义不大7electronmicrographs8inclusion bodycytomegalic cell that contains a dense, owls eye, acidophilic intranuclear inclusion body negry body92. 2. 病毒血清学检查病毒血清学检查 已知抗原已知抗原测抗体测抗体（诊断）（诊断） 已知抗体已知抗体测抗原测抗原（鉴定病毒属、种、（鉴定病毒属、种、 型、亚型）型、亚型）10(1) (1) 中和试验中和试验(neutralization tes

4、t)(neutralization test)(2) (2) 血凝抑制试验血凝抑制试验(hemagglutination inhibition test)(hemagglutination inhibition test)(3) (3) 免疫标记法免疫标记法(fia(fia、eiaeia、ria)ria) 蛋白印迹蛋白印迹(western blot)(western blot)2. 2. 病毒血清学检查病毒血清学检查方法：方法：11immunofluorescense test12immunofluorescense testpositive immunofluorescence test f

5、or rabies virus antigen. (source: cdc)13hel细胞中细胞中cmv ie1蛋白的表达蛋白的表达enzyme immunoassay (eia)14elisacoloured wells indicate reactivity15aids的确诊试验的确诊试验western blot163. 3. 病毒分子生物学检查病毒分子生物学检查 可用于检测常规培养系统不能培养的病毒可用于检测常规培养系统不能培养的病毒 可用于检测少量标本或含少量病毒的标本可用于检测少量标本或含少量病毒的标本 可用于抗体产生前或不能产生抗体的免疫缺陷患者检测可用于抗体产生前或不能产生抗体的

6、免疫缺陷患者检测 可对病毒进行定量检测，有助于疗效监测可对病毒进行定量检测，有助于疗效监测 可对病毒进行可对病毒进行基因分型基因分型 灵敏度高、特异性好、快速、简捷灵敏度高、特异性好、快速、简捷优点：优点：173. 3. 病毒分子生物学检查病毒分子生物学检查 核酸电泳核酸电泳(nucleic acid electrophoresis)(nucleic acid electrophoresis) 核酸杂交核酸杂交(nucleic acid hybridization)(nucleic acid hybridization) 核酸扩增核酸扩增(pcr(pcr） 基因芯片基因芯片(gene chip

7、)(gene chip) 基因测序基因测序(gene sequence)(gene sequence)方法：方法：4. 病毒的分离培养与鉴定病毒的分离培养与鉴定: 病毒的分离培养病毒的分离培养 病毒的鉴定病毒的鉴定 病毒数量及感染性测定病毒数量及感染性测定19病毒的分离培养方法：病毒的分离培养方法： 动物接种动物接种 鸡胚培养鸡胚培养 细胞培养细胞培养:20 动物接种动物接种(animal inoculation)(animal inoculation)动物：动物：鼠、兔、猴、黑猩猩等鼠、兔、猴、黑猩猩等优点：优点：结果易观察，可建立动物模型结果易观察，可建立动物模型缺点：缺点：有饲养条件要求

8、，费用高、动物有饲养条件要求，费用高、动物 体内常带有潜伏病毒。体内常带有潜伏病毒。 目前已很少应用。目前已很少应用。21 鸡胚培养鸡胚培养(embryonated egg culture)(embryonated egg culture)受精卵受精卵孵育孵育10-1210-12天天鸡胚鸡胚接种病毒接种病毒孵育孵育2-72-7天天收获相应的材料进行鉴定收获相应的材料进行鉴定22鸡胚接种部位：鸡胚接种部位：尿囊腔接种尿囊腔接种绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种卵黄囊接种卵黄囊接种羊膜腔接种羊膜腔接种23优点：优点：易管理易管理 不带微生物不带微生物 成本较低成本较低缺点：缺点：操作程序复杂操作程序复杂

9、目前用鸡胚培养的病毒主要是流感病毒目前用鸡胚培养的病毒主要是流感病毒 鸡胚培养鸡胚培养(embryonated egg culture)(embryonated egg culture)24(3) (3) 细胞培养细胞培养(cell culture)(cell culture)根据细胞生长的方式分根据细胞生长的方式分: : 单层细胞培养（单层细胞培养（monolayer cell culturemonolayer cell culture）25根据细胞来源、染色体特征及传代次数分根据细胞来源、染色体特征及传代次数分: : 原代培养细胞原代培养细胞 二倍体细胞株二倍体细胞株 传代细胞系或株传代细

10、胞系或株(3) (3) 细胞培养细胞培养(cell culture)(cell culture)26原代培养细胞（原代培养细胞（primary cultural cells)primary cultural cells)组织组织 组织块组织块 分散的单个细胞分散的单个细胞 单层细胞单层细胞 剪碎 蛋白酶( (原代细胞原代细胞) )单层细胞单层细胞( (次代细胞次代细胞) )传代培养培养基27原代培养细胞（原代培养细胞（primary cultural cells)primary cultural cells)epithelial cells28特点特点: : 对多种病毒敏感对多种病毒敏感 生长

11、能力有限生长能力有限, , 获取成本高获取成本高 可携带潜伏病毒可携带潜伏病毒应用应用: : 病毒分离与鉴定病毒分离与鉴定 病毒学实验研究病毒学实验研究 不能不能用于制备疫苗用于制备疫苗原代培养细胞（原代培养细胞（primary cultural cells)primary cultural cells)29体外分裂体外分裂5050100100代仍保持二倍染色体数目的单型细胞代仍保持二倍染色体数目的单型细胞特点特点: : 对多种病毒敏感对多种病毒敏感 不带异种蛋白不带异种蛋白( (人源性人源性) ) 不带病毒不带病毒, ,无致瘤潜能无致瘤潜能应用应用: : 病毒分离与鉴定病毒分离与鉴定 病毒学

12、实验研究病毒学实验研究 制备疫苗制备疫苗二倍体细胞株二倍体细胞株(diploid cell strain)(diploid cell strain)fibroblastic cells30传代细胞系传代细胞系(continuous cell line )(continuous cell line )特点特点: : 对多种病毒敏感性高对多种病毒敏感性高 繁殖能力强繁殖能力强, ,传代时间长传代时间长 有致癌危险有致癌危险( (来源于癌细来源于癌细胞或突变的二倍体细胞株胞或突变的二倍体细胞株) )应用应用: : 病毒分离与鉴定病毒分离与鉴定 病毒学实验研究病毒学实验研究 不能不能用于制备疫苗用于制

13、备疫苗能在体外无限传代的细胞系。如能在体外无限传代的细胞系。如 hela, hep-2epithelioid cells314. 病毒的分离培养与鉴定病毒的分离培养与鉴定: 病毒的分离培养病毒的分离培养 病毒的鉴定病毒的鉴定 病毒数量及感染性测定病毒数量及感染性测定32病毒鉴定：病毒鉴定： 病毒在细胞中增殖的指标病毒在细胞中增殖的指标 病毒形态学鉴定病毒形态学鉴定 病毒抗原鉴定病毒抗原鉴定 病毒基因鉴定病毒基因鉴定33 细胞病变效应细胞病变效应( cytopathic effect,cpe) 病毒在敏感细胞内增殖引起的光镜下可病毒在敏感细胞内增殖引起的光镜下可见的细胞病理改变。见的细胞病理改变

14、。 34cpecpe：病毒感染细胞发生形态改变：病毒感染细胞发生形态改变35syncytium formation in cell culture caused by rsv (top), and measles virus (bottom). cpe：病毒感染细病毒感染细 胞与邻近细胞融合胞与邻近细胞融合36cpecpe：形成包涵体（：形成包涵体（inclusion bodyinclusion body）37syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface

15、 of the cell sheet. 红细胞吸附（红细胞吸附（hemadsorption, hadhemadsorption, had）受染细胞膜表面血凝素（受染细胞膜表面血凝素（haha） rbcrbc表面表面haha受体受体38 干扰现象（干扰现象（interferenceinterference）风疹病毒人胚肾细胞风疹病毒人胚肾细胞 病毒增殖，病毒增殖，cpecpe（）（）埃可病毒人胚肾细胞埃可病毒人胚肾细胞 病毒增殖，病毒增殖，cpecpe（）（）人胚肾细胞人胚肾细胞风疹病毒风疹病毒？埃可病毒埃可病毒cpe(-)cpe(-)埃可病毒埃可病毒(-) (-) 风疹病毒风疹病毒(+) (+

16、) cpe(+)cpe(+)埃可病毒埃可病毒(+)(+) 风疹病毒风疹病毒(-)(-) 394. 病毒的分离培养与鉴定病毒的分离培养与鉴定: 病毒的分离培养病毒的分离培养 病毒的鉴定病毒的鉴定 病毒数量及感染性测定病毒数量及感染性测定40 病毒数量及感染性测定：病毒数量及感染性测定：蚀蚀( (空空) )斑形成试验斑形成试验 50%50%组织细胞感染量组织细胞感染量病毒总量病毒总量( (活病毒活病毒+ +死病毒死病毒) )：感染性病毒量感染性病毒量: :血凝试验血凝试验41蚀(空)斑形成试验（plaque assay） 原理：原理：适当浓度的感染性病毒在覆盖琼适当浓度的感染性病毒在覆盖琼脂的细胞

17、层上产生可见和可数的局部病脂的细胞层上产生可见和可数的局部病灶称为灶称为蚀蚀斑。一个斑。一个蚀蚀斑是由一个感染性斑是由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的，由病毒颗粒增殖而形成的，由蚀蚀斑的数目斑的数目可以计算出原始标本中感染性病毒的含可以计算出原始标本中感染性病毒的含量。量。plaque assayplaque assayplaque assayplaque assayplaque assayplaque assay 分别为10-1、10-2、10-3倍稀释度的hcmv病毒液感染的hel细胞蚀(空)斑形成试验（plaque assay） 46用途：用途： 测定感染性病毒量测定感染性病毒量 单位单位

18、: pfu (plaque forming unit)/ml: pfu (plaque forming unit)/ml 由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的一个由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的一个空斑称为空斑形成单位。空斑称为空斑形成单位。 分纯病毒分纯病毒蚀(空)斑形成试验（plaque assay） 4750%组织细胞感染量(50% tissue culture infectious dose, tcid50)概念概念: : 测定病毒感染细胞后引起测定病毒感染细胞后引起50%50%细胞病变或细胞病变或死亡的最小病毒量。死亡的最小病毒量。方法方法: :一般是将病毒悬液作一般是将病毒悬液作101

19、0倍的系列稀释，分倍的系列稀释，分别接种细胞，经一定时间后观察别接种细胞，经一定时间后观察cpecpe、血细胞吸、血细胞吸附等指标，以能使附等指标，以能使50%50%细胞感染的病毒的最高稀细胞感染的病毒的最高稀释度作为终点。最后用统计方法计算出释度作为终点。最后用统计方法计算出50%50%组织组织细胞感染量。细胞感染量。用途用途: : 测定感染性病毒的量和毒力测定感染性病毒的量和毒力 分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍稀释度的hcmv感染的hel细胞50%组织细胞感染量(tcid50)49p香港大学专家：患者鼻咽标本香港大学专家：患者鼻咽标本verovero细胞

20、培养细胞培养cpe emcpe em观察：观察：冠状病毒冠状病毒p随后加拿大和美国随后加拿大和美国cdccdc等等sarssars国际协作组的多国际协作组的多个实验室也培养出了个实验室也培养出了冠状病毒冠状病毒p利用利用免疫荧光法免疫荧光法将分离病毒与将分离病毒与sarssars患者血患者血清进行清进行血清学检测血清学检测，反应呈，反应呈阳性阳性p从冠状病毒基因组的保守区设计引物，采用从冠状病毒基因组的保守区设计引物，采用rt-pcrrt-pcr方法从培养上清中扩增出了方法从培养上清中扩增出了冠状病毒基冠状病毒基因因测序测序经经genbankgenbank数据库同源性比对，发现数据库同源性比对，发现同源性为同源性为64%64%左右左右sarssars冠状病毒的分离和鉴定冠状病毒的分离和鉴定50p加拿大专家完成了全基因组测序加拿大专家完成了全基因组测序发现与已知发现与已知人和动物的冠状病毒