重叠PCROverlap

1、重叠pcr (overlap pcr)的基 本原理 及其简单运用2016.06.082重叠延伸pcr技术(gene splicing by overlap extension pcr,简称soe pcr)由于采用具有互补末端的引物,使pcr产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的一项技术。简介特点：u可简单迅速将两个dna片段连在一起，用于嵌合体基因的构建。u可以进行定点突变。u可以在两基因片段间加入其他序列酶切位点或者标签。u丰富的pcr的扩增范围，尤其在获得长dna片段方面，省去常规克隆的繁琐。目的基因5,5,3,3,解旋、退火延伸第二轮

2、扩增大量目的基因多次次扩增pcr图解4运用通过酶切法得到相应的粘性末端，再利用连接酶得到任务：两个基因片段，或者一个基因和启动子、终止子要连接在一起。常用的方法1.没有合适的酶切位点2.酶昂贵，使用少重叠pcr技术迅速、经济、简单易行不可行5几个主要的运用大于10000bp的基因基因a基因b基因a+b目的基因cds1cds2cds3内含子内含子无内含子的编码序列6引物的设计基因1基因2f1 引物r2引物r1引物f2 引物基因1基因2基因1基因2碱基相同区域，至少20bp基因1基因2pcr怎么样发生反应？pcr扩增pcr扩增7反应机理5555333355335533加入酶，buffer等反应液。

3、pcr仪中解链，退火单链模板结合f1 引物r1引物f2 引物r2 引物无目标产物5533加入f1引物、r2引物5533f1 引物r2 引物大量扩增目的基因基因a基因b8在定点突变方面的应用 g c a a a g g c a t c g a c g t t t c c g t a g c tf1引物f2引物r1引物r2引物碱基同源区域突变碱基突变碱基：可以在引物上换成任何其他碱基。碱基同源区域：保证20bp左右，这样有利于overlap pcr 得到目标序列。 g c a a ac g t t tg c a a a t g c a t c g ac g t t t a c g t a g c

4、tf1引物r1引物f2引物r2引物g c a a a t g c a t c g ac g t t t a c g t a g c toverlap pcr得到突变后的目的基因9上述反应体系中，反应液的加入有两种不同的方式u一种是先加入酶，模板（基因a和b）buffer，dntp，水。经过5个循环得到完整的目的基因。然后入引物，大量扩增目的基因。虽然这样操作繁琐，但是可以得到特异性扩增产物。u另外一种是直接一步加入所有需要的反应液。虽然此操作简单省时，但是会出现非特异扩增条带，影响胶回收，产量也会减少。10注意事项1、两基因模板间的重叠部分不能少于20bp，否则退火时模板贴不紧，得不到融合的目

5、的基因。2、四条引物的tm值尽量保持相同或一致，利于引物的灵活使用。3、控制重叠pcr的循环次数比一般pcr少，这样可以减少非特异性条带。4、控制pcr模板的浓度，已经融合模板的比例。一般控制摩尔浓度比为1:1，且质量在20ng左右。11谢 谢12over-lap pcr得到完整基因componentvolume前1067bp片段1 l(20ng)后1174bp片段1 l(20ng)10 la buffer 5 l2.5 mm dntp 4 lla taq 0.5 lpcr grade water38.5 ltotal reaction volume50 l cycling conditionspre-denaturation:98, 2 min.denaturation:98, 30 sec.annealing:60, 30 sec.extension:72,1 min.extension:72,5 min.finally: 4 , .5 cycle加入100 m浓度的f和r引物各0.5 l cycling conditionspre-denaturation:98, 2 min.denaturation:98, 30 sec.annealing:65, 30 sec