考马斯亮蓝法完整版

1、体内药物分析体内药物分析第三章第三章考马斯亮蓝法（考马斯亮蓝法（bradfordb一、基本原理一、基本原理 酸性溶液两者结合，使染料溶液的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。 二、试剂与器材二、试剂与器材 试剂：试剂：（1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝g250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% h3po4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（w/v）考马斯亮蓝g250, 4.7%（w/v）乙醇，8.5%（w/v）h3po4。（2）标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/l nacl

2、配制成100 ug/ml蛋白溶液。2. 器材：器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 三、操作方法三、操作方法1、标准曲线的制作、标准曲线的制作试管编号0123456100ug/ml标准蛋白（ml）0.00.10.20.30.40.50.60.15mol/l nacl （ml）10.90.80.70.60.50.4考马斯亮蓝试剂 （ml）5555555摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色a595nm 以a595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。 2、样品中蛋白质含量

3、的测定、样品中蛋白质含量的测定 另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。四、四、bradford法的优缺点法的优缺点1、优点、优点（1）灵敏度高：蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。（2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。（3）干扰物质少。2、缺点、缺点四、四、bradford法的优缺点法的优缺点（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时

4、有较大的偏差，在制作标准曲线时最好选用 球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 triton x-100、十二烷基硫酸钠（sds）和0.1m的naoh（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 五、注意事项五、注意事项1、 如果要求严格，最好在试剂加入后的520min内测定光 吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。2、 若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。六、思考题六、思考题 说出你所知道的几种蛋白质定量测定的方法，并与考马斯亮蓝染色法相比

5、较各有何优缺点？五种蛋白质测定方法比较如下：五种蛋白质测定方法比较如下： 方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法（kjedahl法）灵敏度低，适用 于 0 . 2 1.0mg氮，误差为 2费时 810小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长双 缩 脲 法（biuret法）灵敏度低120mg中速 2030分钟多肽键碱性cu2紫色络合物硫酸铵；tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏50100g快速 510分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正folin酚试剂法（lowry法）灵敏度高5g慢速 4060分钟 双缩脲反应；磷钼酸磷钨酸试剂被tyr和phe还原硫酸铵；tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法(bradford法)灵敏度最高15g快速51