对虾酚氧化酶原激活系统研究进展

1、 姓名：郑锦滨 学号：22320131151432专业：海洋生物学目录1、 概述概述2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成3、 血蓝蛋白与血蓝蛋白与PO4、环境因子对、环境因子对PO的影响的影响5、 proPO系统激活途径系统激活途径1、 概述概述 甲壳动物缺乏后天获得的特异性免疫功能，但是它们有比较完善的非特异性免疫系统，能够迅速识别和有效清除入侵的微生物。非特异性免疫系统是一种比较原始的免疫系统，它存在于所有多细胞生物体，是免疫防御的第一线，分为细胞免疫和体液免疫。甲壳动物的细胞免疫包括吞噬作用、包围化及结节的形成；体液免疫包括酚氧化酶原激活系统(prophenoloxida

2、se activating system, proPO激活系统)、各种凝集素及抗菌肽等。1、 概述概述 Fig. 1. Outline of the shrimp immune system (mainly the humoral immune response)1、 概述概述 proPO系统是一种类似于脊椎动物补体系统的酶级联系统，在甲壳动物的非特异性免疫系统中起着非常重要的作用。它由酚氧化酶(phenoloxidase, PO)、酚氧化酶原(Prophenoloxidase, proPO)、丝氨酸蛋白酶(serine protei nases, SPs)、模式识别蛋白(patten rec

3、ognition proteins, PRPs)和蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor)等构成。该系统中的因子以非活化状态存在于血颗粒细胞中，极微量的1、 概述概述 微生物多糖如 -1,3-葡聚糖(-1,3-glucans, G)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、肽聚糖(peptidoglycan , PGN)等和钙离子、胰蛋白、SDS可激活该系统，使proPO 变成PO，并产生一系列有生理活性的物质，通过包囊与黑化作用抑制和杀死病原体，达到免疫效果。另外其在表皮硬化和伤口愈合中也发挥着重要的作用。2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成

4、2.1 模式识别蛋白模式识别蛋白(patten recognition proteins，PRPs) 无脊椎动物行使非特异性免疫反应首先是通过体内特定蛋白对病原微生物表面的病原相关分子模式(pathogen- associated molecular patterns , PAMPs)，包括革兰氏阴性菌的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、革兰氏阳性菌的肽聚糖(peptidoglycan , PGN)及真菌的-1,3-葡聚糖(-1,3-glucans, G)进行识别，这种特定蛋白就称为模式识别蛋白(patten recognition proteins, PRPs)。2、

5、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成 目前，已在对虾鉴定出11种PRPs，包括：-1,3-葡聚糖酶相关蛋白(-1,3-glucanase-related proteins, BGRP)-1,3-葡聚糖结合蛋白( -1,3-glucan-binding proteins, BGBPs) C型凝集素(C-type lectins, CTLs)清道夫受体(scavenger receptors, SCR)硫依赖型凝集素(galectins)纤维蛋白原相关蛋白(fibrinogen-related proteins, FREP)含硫酯键蛋白(thioester-containing pro

6、tein, TEP)唐氏综合症细胞粘附分子(Down syndrome cell adhesion molecule, DSCAM)丝氨酸蛋白酶同系物(serine protease homologs, SPH)反式激活应答RNA结合蛋白(trans-activation response RNA-binding protein, TRBP)Toll样受体(Toll-like receptors)2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成PRRsSpeciesReceptor numberFeatured domainLigandsBGRPLitopenaeus vannameiMa

7、rsupenaeus japonicusPenaeus MonodonFenneropenaeus chinensisLitopenaeus stylirostrisFenneropenaeus merguiensis11111 1 Glucanase-like (GLU)-LPS-1,3-glucanG+、G-bacteria-BGBPF. chinensisL. vannamei1M. japonicus311-CTLsF. chinensisF. merguiensisP. monodonL. vannamei7137C-type lectin domain(CTLD)LPS、PGN、L

8、TA-LPSWSSVTable 1 Reported pattern recognition receptors in penaeid shrimp2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成PRRsSpeciesReceptor numberFeatured domainLigandsCTLsM. JaponicusPenaeus semisulcatus41CTLDLPS-SCRM. japonicus1CD36LPS？LTA?FREPM. japanicus1Fibrinogen-like domainPGNLPSTEPL. VannameiM. JaponicusP. Mono

9、donF. chinensis11132M-DSCAMP. MonodonL. vannamei11Ig-like domainfibronectin domain-GalectinM. japonicus1Carbohydratesrecognition domainLPSLTA2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成PRRsSpeciesReceptor numberFeatured domainLigandsSPHP. monodon1Trypsin-like serine proteaseLPSglucanPGNTRBPF. ChinensisM. japonicus1ds

10、RNA-binding domaindsRNAsTLRsF. ChinensisM. JaponicusP. MonodonL. vannamei1213LRRTIR-, Not characterized.2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成 通常情况下PRPs在异物入侵前位于血浆或血细胞表面，具有对多糖的亲和性。当微生物感染生物体时，PRPs 首先与微生物细胞壁上的多糖结合，然后通过与血细胞表面特异受体联结促进颗粒细胞扩张，引发包裹、吞噬、proPO 系统级联发应等，实施机体的非特异性免疫反应。2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成2.1.1 C型凝集素型凝集

11、素(C-type lectins) C-型凝集素几乎存在于所有动植物体内，其凝集活性具有钙离子依赖性。C-型凝集素的主要特征是在蛋白质分子的C 末端含有糖识别结构域CRD。作为一种模式识别受体，C-型凝集素参与“非己”识别和对入侵病原的清除过程。据报道，无脊椎动物C-型凝集素可参与多种免疫反应：激活酚氧化酶原、抗菌、吞噬、包囊、黑化作用以及结节的形成等, 在先天性免疫防御中具有重要作用。2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成近几年，对虾C-型凝集素的研究也逐渐开展起来, 目前已在中国明对虾(F.chinensis)、凡纳滨对虾(L.vannamei)、日本囊对虾(M.aponic

12、us)、墨吉明对虾(F.merguiensis)等多种对虾中发现C-型凝集素的存在。2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成Table 2 Different types of C-type lectins reported in Penaeid shrimp2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成 Fig. 2. Domain architectures of shrimp lectins.2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成 Fig. 3. The functions of shrimp C-type lectins2、 proPO激活系统激活系统的

13、基本组成的基本组成 2.1.2 Toll样受样受(Toll-like receptors，TLRs) TLRs是进化中比较保守的一个受体家族。 TLRs由三部分组成：富含亮氨酸重复的胞外区(LRR) 、跨膜螺旋和胞内的Toll-白介素1受体结构域(TIR)，能特异识别PAMP，招募特异接头蛋白，激活一系列信号级联反应，在天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要的作用，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。TLRs虽然在脊椎动物中作为一种模式识别受体发挥作用,但是在无脊椎动物中这类受体并不与病原体直接接触,而是作为一种跨膜的信号转导分子行使功能。2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成 Fig

14、. 4. Phylogenetic tree analysis of TLRs2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成Note: G, gill; L, lymphoid organ; I: intestine; Hp: hepatopancreas; Hc, hemocytes; Ht, heart; up, differentially up-regulated; down, differentially down-regulated; modulated,different regulation trends at different post-infection time;

15、 none, no obvious difference; /, not available.Table 3 The canonical components of Toll signaling pathway identified in penaeid shrimp2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成 Fig. 5. Comparison of Toll pathways in shrimp and Drosophila.2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成2.2丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶(serine proteinases, SPs) 丝氨酸蛋白酶(seri

16、ne proteinases, SPs)是一类以丝氨酸为活性中心的蛋白水解酶，不仅参与机体消化、胚胎发育、组织重建、细胞分化及血管形成等过程，而且在抵御病原体入侵的过程中起着非常重要的作用。参与免疫反应的SPs 通常以酶原的形式合成，储存在膜泡内或颗粒中，然后被转运或释放到细胞外，通过与特异的蛋白酶结合，在其活性位点水解断裂，使之活化，形成级联反应，并快速启动相应的免疫防御系统，抵御病原体的感染。2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成 丝氨酸蛋白酶的活性部位都含有组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸，形成催化三联体。目前，已在昆虫和甲壳动物中发现了几种参与proPO系统激活的SPs，它们都属

17、于含有发夹结构域的丝氨酸蛋白酶 (Clip-domain serine proteinase , Clip-SPs)。 Clip-SPs通常以酶原的形式合成，其N端具有12个Clip结构域，C端起催化作用的SP结构域。Clip结构域通常由3755个氨基酸残基组成，并通过3 个严格保守的二硫键相互连接，形成紧凑结构，进而通过2392 个氨基酸残基与SP 结构域连接。2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成Fig. 6. Schematic illustration of Prophenoloxidase-activating emzymes of the penaeid shrimp

18、 P. monodon2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成 Clip-SPs分为具催化活性的SPs和无催化活性的SPs丝氨酸蛋白酶同源物(Clip-SP homologs, Clip-SPHs)，二者的氨基酸序列相似，但Clip-SPHs由于一个或多个催化残基的缺失或突变(如: Clip-SPHs催化三联体中的丝氨酸被甘氨酸取代)导致其明显缺乏酰胺酶活力。目前已有文献证实，SPHs在节肢动物中参与酚氧化酶原系统的激活和抗微生物应答。当没有SPHs时，proPO能够被SPs在正确的位置裂解，但是却不能显现PO的活性。因此有人推断，SPs和SPHs的发夹结构域对proPO的活化作用

19、很关键，SPHs很可能改变了PO的构象而导致其活化，但目前SPHs与PO之间的直接反应关系还没有被确认。2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成Fig. 7. Bootstrapped unrooted neighbor-joining tree of the serine proteinase domain of clip-SPs and clip-SPHs from arthropods2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成2.3酚氧化酶酚氧化酶(phenoloxidase, PO)和酚氧化酶原和酚氧化酶原(Prophenoloxidase, proPO) 酚氧化

20、酶(phenoloxidase, PO)又称为酪氨酸酶(tyrosinase)，在无脊椎动物和脊椎动物中都有发现，其活性部位含有2个铜原子(CuA和CuB)，能够催化酚类物质形成最终的反应产物黑色素。无脊椎动物 PO 一般以无活性状态的proPO存在，ProPO产生于血淋巴中成熟的血细胞，如颗粒细胞和半颗粒细胞，经丝氨酸蛋白酶裂解变成有活性的 PO。1996 年，Sugumaran建议：酪氨酸酶这个名字应专门用于哺乳类，而 PO 专门用于无脊椎动物。FujimotoK对它们进行序列分析，结果显示它们来源于两个相对独立的分支，从序列相似性考虑，酪氨酸酶可能起源于软体动物的血蓝蛋白，PO 可能起源

21、于节肢动物的血蓝蛋白。 2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成 Fig. 8. Schematic illustration of Prophenoloxidase of P. monodonFig. 9. Bright-field photomicrographs showing the cytochemical localization ofphenoloxidase in Penaeus monodon hemocytes incubated with dopamine.A：Hyaline cell with none or few fine granules. B：Sem

22、igranular cell withmoderate and variable number of granules of various shapes and sizes.C： Granular cell whose cytoplasm is fully packed with granules. 2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成 PO能够催化单酚羟化成二酚，并把二酚氧化成醌，醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素。这些黑色素协同具有细胞毒性的醌类中间产物沉积到入侵的病原体周围，起到隔离杀死病原体的作用，即所谓的黑化

23、包被反应。在较高等的无脊椎动物如节肢动物中，PO 具有多种功能，它不仅参与黑色素形成、角质的硬化和伤口愈合，而且在宿主的防御反应中还作为非自身识别系统发挥功能，在识别异物、释放调理素(opsonin)、促进血细胞的吞噬和包囊反应以及促进颗粒细胞和半颗粒细胞释放颗粒、产生多种介导凝集因子及抗菌肽等免疫功能方面发挥着重要的作用。PO活力的强弱与机体的免疫力直接相关，可作为衡量甲壳动物免疫功能大小的指标之一。2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成 目前，已克隆了斑节对虾(P.monodon)、凡纳滨对虾(L.vannamei)、日本囊对虾(M.japonicus)及中国明对虾(F.ch

24、inensis)及短沟对虾(P.semisulcatus)proPO 的cDNA 序列。甲壳动物proPO 的cDNA序列长约2500bp，如凡纳滨对虾(L.vannamei)的为2471 bp，序列中含有高度保守的两个铜结合位点，即5 个糖基化位点和6 个组氨酸残基，整个序列没有信号肽。ProPO 经丝氨酸蛋白酶裂解转变为具活性的PO，一般会有一段约50 个氨基酸的肽链从proPO 上切除。而这个酶切位点及其周围的氨基酸序列在同一物种中也是非常保守的，如斑节对虾的酶切位点在Arg44Val45。2、 proPO激活系统激活系统的基本组成的基本组成Fig. 10. Neighbor-joini

25、ng phylogenetic trees of prophenoloxidase3、血蓝蛋白血蓝蛋白与与PO 在动物界进化过程中, 出现了3 种重要的呼吸蛋白: 蚯蚓血红蛋白(hemerythrin) 、血蓝蛋白(hemocyanin) 和血红蛋白( hemoglobin) 。这3 种呼吸蛋白是同功非同源关系, 尤其是血蓝蛋白, 不仅在非线性分子进化中具有承上启下的重要意义, 而且至今依然是多数甲壳动物和软体动物( 头足类和腹足类) 的呼吸蛋白, 它在动物界中的分布范围仅次于血红蛋白。血蓝蛋白是一类含有铜离子的寡聚蛋白，起着运送氧的重要功能。但是，最近的研究发现，在一定条件下血蓝蛋白具有PO

26、的活性。 3、血蓝蛋白血蓝蛋白与与PO Fig. 11. Structure of crustacean and mollusc hemocyaninsA：甲壳动物血蓝蛋白六聚体的形状, 六个花瓣状构造分别为血蓝蛋白的六个亚基； B： 甲壳动物血蓝蛋白六聚体中第二结构域集中在六聚体中央区域, 其它两个结构域分布在六聚体周围；C： 软体动物血蓝蛋白的四级结构；D: 美洲鲎血蓝蛋白的活性部位，两个蓝色的圆球体为CuA 和CuB, 红色圆球体为氧分子，绿色片段为组氨酸， 每三个组氨酸分别与一个Cu 结合。3、血蓝蛋白血蓝蛋白与与PO 血蓝蛋白和PO 虽然在结构上有相似点，如两者都是含双铜的蛋白，这两

27、个铜位点就是它们的活性部位，且都分别与三个组氨酸残基连在一起。但是，两者却有着许多不同点，如它们的生成器官是不同的，血蓝蛋白在肝胰腺中生成，而proPO 在成熟血细胞中生成。另外，将螯虾的PO 与血蓝蛋白进行理化特性比较发现，血蓝蛋白的表面带有较多的负电并较PO 的疏水性弱，血蓝蛋白有信号肽，而PO 没有信号肽。3、血蓝蛋白血蓝蛋白与与PO 对血蓝蛋白结构的研究发现，当血蓝蛋白执行携氧功能时，由于一些重要的氨基酸残基的阻挡，其活性部位只允许氧分子进入，酚类底物不能进入。对螯(Pacifastacus leniusculus)、黄道蟹(Cancer magister)等的研究表明，在血蓝蛋白的N

28、末端发生蛋白质水解或将氨基酸残基拉出活性部位使其结构改变或部分展开后，血蓝蛋白的铜位点能与更大的底物，如酚类物质结合，从而使之具有PO功能，完成黑化。4、环境因子对、环境因子对PO的影响的影响 海产甲壳动物极易受到多种环境因子的影响，其生存环境随季节及昼夜更替而发生变化，且污染物及气候等因素导致水环境的变化均能抑制甲壳动物的免疫力。已有研究报道环境因子变化，如温度、盐度及PH等均能导致甲壳动物血细胞数量的调整及酚氧化酶原活力的变化，导致免疫力下降，对病原菌易感。 甲壳动物酚氧化酶原激活系统可能存在多种不同的激活机制，由此引发免疫应答的效应也有所不同，环境刺激(如温度、盐度、PH)引起甲壳动物发

29、生一系列非特异性应激反应，能启动酚氧化酶作用，这是机体代谢上的一种免疫应激适应，而与异物入侵、自发激活等具有不同的免疫应答机制。4、环境因子对、环境因子对PO的影响的影响4.1 温度温度 温度是养殖水环境中最重要环境因子之一，能直接影响对虾的存活、生长和代谢强度等。对虾属于变温动物，其体温随着环境温度的变化而改变，而环境温度的不同必然会影响机体的新陈代谢和生理调节机制。许多学者研究发现当环境因子发生变化后，对虾因应激反应，引起自身的免疫力下降，而对病原的易感性提高，从而导致虾病暴发。 虾类的生长发育存在最适温度，同样，虾类的免疫反应也有最适温度，超出适温范围免疫反应下降。温度突变可阻碍机体的稳定状态，成为胁迫因子，使其免疫反