小鼠前向运动精子分离采集技术改良

1、小鼠前向运动精子分离采集技术改良【摘要】 目的 提高从小鼠附睾采集的精子中前向运动精子的比例。 方法 设计“双舱培养皿”和“双舱浮游法（B法）”采集小鼠精子,并与当前普遍采用的“常规浮游法（A法）”进行配对比较实验。采用A,B法分别采集同一只小鼠的双侧附睾精子。 结果 前向运动精子活跃地从“双舱培养皿”的内舱游出至外舱。A、B两法分离得到的前向运动精子百分率分别为(56.83±7.23)和(77.33±5.69),变异系数分别为12.72和7.36,差别具有统计学意义。 结论 “B法”能稳定显著地提高前向运动精子的百分率,优于“A法”。 【关键词】 附睾 精子 精子能动性

2、疾病模型 动物 ABSTRACT: Objective The technique of mouse sperm collection is common used in many fields of life science currently. The aim of this research is in order to improve the ratio of forward motile sperm collecting from mouse epididymides. Method A novel "double chambers dish" and conve

3、nient "double chambers swim" method were designed and compared with "conventional swimup" method which is in common used nowadays. Experiments showed that the forward motile sperm swimout actively from the innerchamber and the rate of forward motile sperm increased. Sperm was col

4、lected from different side of the same mouse by using "conventional swimup" or "double chambers swim" method,respectively. Result The means of the rate of forward motile sperm collected were 56.83±7.23 with CV12.72 in “conventional swimup” group and 77.33±5.69 with CV7.

5、36 in “double chambers swim” group, respectively. Statistical analysis showed there are significant differences between two datas according to the paired ttest. Conclusion The “double chambers swim” method can improve the ratio of the forward motile sperm stably and observably and would be a better

6、method in mouse sperm collection. KEY WORDS: epididymis； sperm； perm motility； disease models,animal 福建医科大学学报 2008年7月 第42卷第4期江 帆等：小鼠前向运动精子分离采集技术改良小鼠精子采集技术是受精机制研究和生殖工程中常用的实验方法1。自然小鼠精液中含有结构、功能并不一致的多种精子和少量生殖道脱落细胞,只有活跃向前运动的精子（前向运动精子）具有正常生理功能,才能游到受精地点与卵细胞发生受精。因此,快速简便地获得高百分率的前向运动精子,是进行实验的重要前提。目前国内外普遍采用的“常

7、规浮游法（A法）”是将含有成熟精子的小鼠附睾尾或输精管放在培养液里剪开,让其中的前向运动精子浮游到培养液中2,其收获的前向运动精子的百分率不高且不稳定。笔者改良设计一种新型简便的“双舱浮游法（B法）”,并与A法进行比较。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 仪器35 mm塑料培养皿（江苏海门联合塑料制品公司）, 0.5 mL微型塑料离心管（EP管, 江苏碧云天生物技术研究所）,20 mL一次性无菌注射器（福建莆田仁德医疗器械有限公司）,血球分类计数器（福建罗源医疗器械二厂）,超净工作台（HF safe 1200,上海力申科学仪器有限公司）,CO2培养箱（BB16HF,上海力申科学仪器有限公司）

8、,光学显微镜（BHT112,日本Olympus公司）。1.1.2 动物812周龄的普通级雄性昆明小鼠，体质量1825 g（福建医科大学实验动物中心）。1.1.3 试剂小鼠精子培养液M16按文献3配制,配方主要成分为：NaCl，KCl，KH2PO4，MgSO4·7H2O，乳酸钠,葡萄糖,青霉素,链霉素,碳酸氢钠,丙酮酸钠,氯化钙（均为国产分析纯试剂）,BSA（Fraction, 美国Sigma A3311）；胚胎培养级轻质矿物油（Sigma，M8410）,氯仿（广东汕头西陇化工厂）,生理盐水（福州海王福药制药有限公司）。1.2 方法1.2.1 “B法”精子采集方案设计“A法”是在直径3

9、5 mm的培养皿中央加入约1.0 mL培养液形成一个液滴,液滴四周及其表面覆盖矿物油；小鼠附睾尾放在液滴中央剪开,使精液从组织中扩散到培养液里；培养一段时间后从液滴的上层吸取悬液以收获游出的精子（图1A）。 本研究设计的“B法”在上述培养皿中央增加2个直径不同的同心圆环,制成“双舱培养皿”。 内环加入培养液并使其溢出至外环形成一个大液滴,液滴覆盖的区域构成内、外半隔断的2个“舱”；小鼠附睾尾放在内舱中剪开,精液只在内舱中扩散,而前向运动精子则可以跨越内环而游到外舱；培养一段时间后从外舱底部吸取悬液以收获游出的精子,大部分运动功能差及或死亡的精子将被挡在内舱而被排除（图1B）,从而分离出前向运动

10、精子。1.2.2 双舱培养皿制作用手术刀平整切下0.5 mL EP管内盖上凸出的圆环（直径约8 mm,高约3 mm）,于氯仿中浸泡下缘3 min左右,镊子夹起圆环立即贴于35 mm塑料培养皿中央作为内环；再从20 mL塑料注射器上剪下一圈圆环(直径约22 mm,高约2 mm)同法浸泡后套在内环之外作为外环,高度略矮于内环。内外2圆环组成同心圆,确认内外环都贴紧培养皿而无缝隙,即制成双舱培养皿（图2）,内环之内的区域称为内舱,内、外环之间的区域称为外舱。1.2.3 附睾尾取材在超净工作台无菌条件下操作。“脊椎错位法”处死小鼠,仰卧,酒精喷洒体表消毒,在其下腹部横向剪开一道小口,纵向撕开,暴露腹壁

11、肌肉,组织镊捏起膀胱投影区上方腹壁肌肉,轻微抖动避免内脏粘连,提起后横向剪开至腹壁两侧,充分暴露其下脂肪囊；拉出脂肪囊,暴露睾丸和附睾,镊子夹住附睾体的尾部末端,剥离附睾尾周围的脂肪和血管,沿镊子夹取部位剪下双侧附睾尾,放入生理盐水中清洗表面残留脂肪及血污。1.2.4 精子采集每次实验对同一只小鼠左右两侧附睾尾分别随机编为A、B组：A组将附睾尾置于培养皿液滴中央,采用“A法”采集精子；B组将附睾尾置于培养皿内环中,采用“B法”采集。切碎附睾尾时注意动作尽量轻巧,避免过分振动。将培养皿移入培养箱中，37 、体积分数为0.05的CO2培养15 min后移出至超净台上,用1 000 L可调微量移液器

12、分别从2组吸取500 L精子悬液并装入2个1.5 mL EP管中。A组从液滴的上层吸取悬液,B组则从外舱的底部贴近内环处吸取悬液（图1）。将EP管中的1只移回培养箱中培养等待检查,另1只EP管的精子悬液立即进行显微观察与计数。1.2.5 显微观察与计数用200 L可调微量移液器对EP管中的精子悬液反复吹吸数次使精子混匀,吸取40 L精子悬液滴加在载玻片上,覆盖盖玻片后观察。对盖玻片中央和四角（避免盖玻片边沿）的5个区域内精子进行观察和计数。利用血球分类计数器对“前向运动精子”和“非前向运动精子”的数目进行分别计数,每片样本计数精子总数（前向运动精子数非前向运动精子数）200个。1.2.6 前向

13、运动精子百分率计算 分别计算A、B样品的前向运动精子百分率,计算方法为：前向运动精子数（forward movement sperm number, FMSN）除以精子总数（total sperm number, TSN）再乘以100%,即等于前向运动精子百分率（forward movement sperm rate, FMSR）。 FMSR=FMSN/TSN×100%1.3 统计学处理采用MicroCal Oringin 3.0（MicroCal Software Inc.）分别统计出2组前向运动精子百分率的x±s,计算变异系数（CV= Mean/SD）并绘制成柱形图。采

14、用配对资料t检验对均数进行显著性检验,P<0.05为差别有统计学意义。2 结 果 共进行12例配对实验。A,B组的前向运动精子百分率均值分别(56.83±7.23)和(77.33±5.69),CV分别为12.72和7.36。配对资料t检验显示差别具有显著统计学意义（P0.01）, B组显著高于A组（图3）。3 讨 论3.1 2种精子采集技术的比较小鼠精子采集技术不仅应用于直接与生殖相关的研究课题,如受精机制研究、辅助生殖医学技术研发和生殖毒理学研究等,也是当前功能基因组学时代转基因小鼠制备中不可或缺的实验步骤46。在常用的多种活细胞分离技术中,密度梯度离心和流

15、式细胞仪的分离纯度高,但要求样本量较大,且耗时较长,所需材料和设备昂贵。由于小鼠的原始精液量少、精子获能时程短（60120 min）,精子离开附睾尾后将较快发生生理生化的改变。因此,与其它体细胞或大型动物的精子不同,小鼠精子的分离采集不宜采用密度梯度离心和流式细胞仪这类高技术,而是利用精子的前向运动特性,采用“浮游”法分离。但此法要求较高的操作技巧,且方法不稳定,难于获得满意的百分率,失败率较高2。“A法”中不同状态的多种细胞混杂在同一个“舱”里,收获精子悬液时,一些运动功能差及或死亡精子也随液流被吸出。基于此现状,本研究设计“B法”以改良小鼠前向运动精子的分离采集技术。此法除了采用的培养皿与

16、常规法有别外,整体实验程序与常规方法一样简便、快速,在操作手法上甚至比常规方法更易于把握。实验结果提示,“B法”采集到的前向运动精子百分率高于“A法”,CV明显低于“A法”,说明“B法”得到的数据稳定性较高,且可以极显著地提高前向运动精子的百分率。3.2 “B法”技术优势分析“B法”显著提高前向运动精子比例的原因：（1）附睾尾放在内舱中,在剪碎组织和随后将培养皿移入或移出培养箱等操作中,附睾尾被局限于相对狭小的内舱不易移动,避免造成较大的液体波动而减少非前向运动精子及其它组织碎片在培养液中随机扩散；（2）附睾尾切开,精液流出组织后将主要在内舱中扩散。内环具有一定高度,只有前向运动精子能够游到其

17、顶端并跨越到外舱,而非前向运动精子绝大部分将被内环阻挡在内舱区域并逐渐沉降于内舱底部,从而实现了前向运动精子与非前向运动精子在一定程度上的区域分离。因重力的关系,游出到外舱的精子可能逐渐沉降到舱底而比较难于游回到内舱。故随时间推移,外舱中的前向运动精子数量将有富集的趋势；（3）在吸取精子悬液时,“B法”要求从外舱的底部贴近内环处吸取悬液,可最大限度减少内舱中产生液流,避免内舱区域中高比例的非前向运动精子被吸出。 在实际操作过程中,培养皿及其液滴难免受到一些振动,大量前向运动精子从内舱游出时也会形成微小的液体潜流,这些因素都可造成一些非前向运动精子漂浮于液滴中,在吸取悬液时被采集。因此,“B法”

18、采集到的精子中,仍将有一部分非前向运动精子。另外,本研究为了适应多种实验目的需要,采用了较短的分离采集时间（15 min）,内舱区域中漂浮的“非前向运动精子”可能还未充分沉降,以致其中的一部分随吸取悬液时产生的液流被吸出,从而降低了前向运动精子的百分率。这可能是本研究中平均前向运动精子百分率尚不是很高的原因。对于单纯为了获取前向运动精子进行体外受精的研究而言,可以将精子采集步骤与随后的精子获能步骤合二而一,故允许培养皿在CO2培养箱里停留更长时间,则将有更多的非前向运动精子充分沉降于内舱,有望进一步提高前向运动精子百分率。3.3 “B法”的推广价值“B法”的基本原理是促使前向运动精子与非前向运动精子的区域分离,所有哺乳动物的正常精子皆有前向运动特性,故此法不仅可应用于大鼠、金黄地鼠及其它在体积、附睾结构和精子结构及功能特性上与小鼠相类似小动物的前向运动精子分离采集,也可以推广设计出适应于各种哺乳动物精子的分离采集技术。【参考文献】 1 Lavitrano M,