实验三血清球蛋白的分离纯化及鉴定七年制参考PPT

1、血清血清球蛋白的球蛋白的分离纯化与鉴定分离纯化与鉴定刘晓如【实验目的实验目的】1 1学习盐析法、凝胶层析和离子交换层析分离纯学习盐析法、凝胶层析和离子交换层析分离纯 化蛋白质的基本原理及应用化蛋白质的基本原理及应用2 2掌握醋酸纤维薄膜电泳技术的原理及应用掌握醋酸纤维薄膜电泳技术的原理及应用3 3了解蛋白质分离纯化的总体思路了解蛋白质分离纯化的总体思路【实验方法实验方法】 一、盐析法粗分一、盐析法粗分-球蛋白球蛋白 二、凝胶过滤方法脱盐二、凝胶过滤方法脱盐 三、离子交换层析方法纯化三、离子交换层析方法纯化-球蛋白球蛋白 四、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定四、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定-球蛋白的纯度球蛋

2、白的纯度【基本原理基本原理】 蛋白质的分离、纯化及鉴定蛋白质的分离、纯化及鉴定是研究蛋白质化学性是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段之一。质及生物学功能的重要手段之一。 不同蛋白质的不同蛋白质的分子量、溶解度分子量、溶解度及在一定条件下，及在一定条件下，带带电的情况电的情况等都有所不同。利用这些性质的差别，可分等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。离纯化各种蛋白质。分离蛋白质的方法分离蛋白质的方法分离方法分离方法沉淀法沉淀法盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法层析法层析法 电学法电学法电泳法电泳法等电聚焦等电聚焦超速离心法超速离心法离子交换层析离子交换层析吸附层析吸

3、附层析凝胶过滤（分子筛）凝胶过滤（分子筛）亲和层析亲和层析在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。【基本原理基本原理】 本实验采用本实验采用硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过滤、离子交换层析滤、离子交换层析方法，分离纯化血清方法，分离纯化血清-球蛋白。最后用球蛋白。最后用醋酸纤维素薄膜电泳法醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定鉴定-球蛋白的纯度。球蛋白的纯度。 7分段盐析去除杂蛋白分段盐析去除杂蛋白凝胶层析脱盐凝胶层析脱盐交联葡聚糖吸水浓缩交联葡聚糖吸水浓缩醋酸纤维素薄膜电泳鉴

4、定醋酸纤维素薄膜电泳鉴定离子交换层析纯化离子交换层析纯化 盐析法是根据不同蛋白质在不同浓度的盐析法是根据不同蛋白质在不同浓度的中性盐溶液中中性盐溶液中溶解度溶解度不同，分别析出，达到不同，分别析出，达到彼此分离的方法。彼此分离的方法。 本实验在本实验在半饱和硫酸铵半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白溶液中，清蛋白溶解，溶解，球蛋白将沉淀球蛋白将沉淀析出，经离心所得的沉析出，经离心所得的沉淀即为球蛋白的粗提液。淀即为球蛋白的粗提液。定义定义：加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并使从溶液中沉淀析出的现象。定因素并使从溶液中沉淀析出的现象。 原理原理: : 破坏蛋白质两个稳定因

5、素：破坏蛋白质两个稳定因素： 水化膜和电荷层水化膜和电荷层中性盐：中性盐：(nh(nh4 4) )2 2soso4 4、nana2 2soso4 4、naclnacl等。等。优点：优点：蛋白质不变性，常用。蛋白质不变性，常用。盐析步骤盐析步骤取离心管一支加入血清取离心管一支加入血清 2ml加入加入2ml 0.9%氯化钠摇匀氯化钠摇匀边搅拌混匀边缓慢滴加饱和边搅拌混匀边缓慢滴加饱和(nh4)2so4 4ml上清液（主要含清蛋白）上清液（主要含清蛋白）倾去倾去静置静置10min，再离心（，再离心（5000转转/分）分）10min沉淀用沉淀用1ml 0.9%氯化钠搅拌溶解氯化钠搅拌溶解逐滴加饱和逐滴

6、加饱和(nh4)2so4 2ml, ,摇匀摇匀静置静置10min，再离心，再离心（5000转转/分）分）10min倾弃上清液（主要含倾弃上清液（主要含、球蛋白）球蛋白）沉淀即为初步纯沉淀即为初步纯化的化的球蛋白球蛋白加入加入0.0175mol/l磷酸缓冲液磷酸缓冲液（ph=6.3)1ml溶解溶解球蛋白球蛋白粗提液粗提液二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐 欲去除盐析法分离得到的球蛋白粗提液中大量欲去除盐析法分离得到的球蛋白粗提液中大量盐，通常有两种方法：盐，通常有两种方法： 凝胶层析法、透析凝胶层析法、透析本试验采用本试验采用葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶sephadex g 25sepha

7、dex g 25层析层析方法方法除去球蛋白粗提液中的盐除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵硫酸铵，以便下一步用离子，以便下一步用离子交换层析方法进一步提纯球蛋白。交换层析方法进一步提纯球蛋白。 凝胶层析凝胶层析原理：原理：p31凝胶层析法是按混合物各组分凝胶层析法是按混合物各组分分子量分子量大小大小不同随不同随流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。 是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，凝胶凝胶直径大于凝胶网孔的直径大于凝胶网孔的不能进入凝胶内部，只不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短

8、、能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、流速快，首先流出层析柱；而流速快，首先流出层析柱；而直径小于凝胶直径小于凝胶网孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定网孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定时间时间。 凝胶柱层析脱盐凝胶柱层析脱盐数学模型 vo vi vtvivi凝胶孔内水（内水）凝胶孔内水（内水）vovo颗粒间水（外水）颗粒间水（外水）vgvg凝胶体积凝胶体积总体积总体积vtvt= = vi vi + +vovo+ +vgvg17kd kd 分配系数：精确衡量混合物中某一待分配系数：精确衡量混合物中某一待分离成分在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分分离成分

9、在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗粒的程度，是溶质分子大小的一子进入凝胶颗粒的程度，是溶质分子大小的一个函数个函数veve洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱液体积液体积 k kd d=(v=(ve e-v-vo o)/v)/vi i 洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓度度/ /吸光度为纵坐标作图吸光度为纵坐标作图18（1 1）完全被排阻的极端大分子，）完全被排阻的极端大分子，veve= =vovo，kdkd=0=0（2 2）中等分子，）中等分子，veve= =vovo+ +kdkdvivi，00kdkd11（

10、3 3）完全渗透的小分子，）完全渗透的小分子，veve= =vovo+ +vivi， kdkd=1=11 1、层析柱保持垂直。层析柱保持垂直。2 2、放蒸馏水，排出空气，关闭出口。、放蒸馏水，排出空气，关闭出口。3 3、加入搅拌均匀的、加入搅拌均匀的sephadexg-25悬液，调节流速悬液，调节流速10滴滴/min，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至18cm。4、上留、上留1-2mm的水，关闭出口。的水，关闭出口。 床面上要保持少许床面上要保持少许水，水， ，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降， 使表面平整。使表面平整。1、加样：、加样

11、：用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样品品 溶液渗入凝胶。溶液渗入凝胶。2、洗脱：、洗脱：加入洗脱液，打开出口，保持流速加入洗脱液，打开出口，保持流速10滴滴/min，收，收 集洗脱液，每管收集集洗脱液，每管收集1ml。用。用。3、保存：、保存：，保，保存存 含量高的进一步纯化含量高的进一步纯化 不断加洗脱液，使不断加洗脱液，使全部流出，为下次实验做准备全部流出，为下次实验做准备 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10上样上样球蛋白，球蛋白， 粗提液粗提液 装柱装柱 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶g-25， 柱高柱高18-20cm流速：每分钟流速：每分钟

12、10滴左右滴左右收集收集 20滴换滴换一支试管一支试管. .层析后洗脱液检测层析后洗脱液检测白色比色板白色比色板, ,洗净备用。洗净备用。一块在各孔滴加奈氏试剂（检测一块在各孔滴加奈氏试剂（检测nhnh4 4+ +）, ,另一块另一块滴加滴加20%20%璜基水杨酸（检测蛋白质）。璜基水杨酸（检测蛋白质）。不用滴管不用滴管, ,避免污染避免污染, ,直接倒直接倒用用“-”-”表示无现象，用表示无现象，用“+”, “+”, “+”+”, “+”, “+”等表示颜色深浅等表示颜色深浅1 . 凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏 。 2. 加样分离时，滴速越慢，分离效果

13、越好。加样分离时，滴速越慢，分离效果越好。 以管号为横轴，蛋白以管号为横轴，蛋白质含量为纵轴绘制洗脱质含量为纵轴绘制洗脱曲线，分析实验结果。曲线，分析实验结果。 1. 1. 通过使用通过使用进一步进一步 纯化纯化-球蛋白脱盐液，得到较纯的球蛋白脱盐液，得到较纯的-球蛋白溶液球蛋白溶液 2. 2. 学习了解离子交换层析方法的基本原理和应用学习了解离子交换层析方法的基本原理和应用 离子交换层析是一种常用的、通过使用各种类型的离离子交换层析是一种常用的、通过使用各种类型的离子交换剂达到分离纯化目的的层析方法。离子交换剂是通子交换剂达到分离纯化目的的层析方法。离子交换剂是通过化学反应将带电基团引入到惰

14、性支持物上形成的固体物过化学反应将带电基团引入到惰性支持物上形成的固体物质，在实验中作为固定相。如果其带负电，则能结合阳离质，在实验中作为固定相。如果其带负电，则能结合阳离子，成为子，成为阳离子交换剂阳离子交换剂；如果其带正电，则能结合阴离子，；如果其带正电，则能结合阴离子，称为称为阴离子交换剂阴离子交换剂。可根据实验需要，选择不同的离子交。可根据实验需要，选择不同的离子交换剂进行离子交换层析。换剂进行离子交换层析。 deae deae （二乙基氨基乙基）纤维素（二乙基氨基乙基）纤维素含有可离子化的碱含有可离子化的碱基，可与氢离子结合，成为带正电荷的阴离子交换剂。基，可与氢离子结合，成为带正电

15、荷的阴离子交换剂。 血清血清、球蛋白、清蛋白的等电点为：球蛋白、清蛋白的等电点为： 清蛋白清蛋白pi= =4.64， 2球蛋白球蛋白 pi= =5.06， 球蛋白球蛋白pi= =5.12， 球蛋白球蛋白pi= =7.3 本实验采用本实验采用0.0175 mol/l ph6.5 nh4ac缓冲液缓冲液进行洗脱。此进行洗脱。此ph，deae带正电荷，可与带负电荷的带正电荷，可与带负电荷的、-球蛋白和清蛋白结合，而球蛋白和清蛋白结合，而带正电荷的带正电荷的-球蛋白球蛋白不与不与deaedeae结合，首先从层析柱中洗脱出来结合，首先从层析柱中洗脱出来，首先收集，首先收集到的既是纯化的到的既是纯化的-球

16、蛋白。球蛋白。 将脱盐后的球蛋白加于将脱盐后的球蛋白加于deae柱上（方法同柱上（方法同凝胶过滤），用凝胶过滤），用0.0175 mol/l ph 6.3 nh4ac缓冲液洗脱，流速缓冲液洗脱，流速10滴滴15滴滴/分，用小试管连分，用小试管连续收集流出液（约续收集流出液（约1.0 ml/管），用管），用20%20%磺基水杨磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况酸溶液检查蛋白质分布情况，收集含量最高的部，收集含量最高的部分，浓缩作纯度鉴定。用该缓冲液洗脱下来的是分，浓缩作纯度鉴定。用该缓冲液洗脱下来的是球蛋白。球蛋白。. .使用离心机的操作注意事项。使用离心机的操作注意事项。. .装柱时检查是否漏水

17、。装柱时检查是否漏水。. .装柱后凝胶装柱后凝胶均一无断层，无气泡，柱床面平整均一无断层，无气泡，柱床面平整。. .柱床面保持有缓冲液。柱床面保持有缓冲液。. .加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整。加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整。. .每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被测样品交叉污染。测样品交叉污染。 利用葡聚糖凝胶富含羟基，吸水，不允许大利用葡聚糖凝胶富含羟基，吸水，不允许大分子蛋白进入微孔的特性，在样品溶液中加少量分子蛋白进入微孔的特性，在样品溶液中加少量凝胶，离心，浓缩蛋白。凝胶，离心，浓缩蛋白。 每每mlml纯化纯化球蛋

18、白溶液加球蛋白溶液加sephadex g-25 0.25 gsephadex g-25 0.25 g，摇动摇动2 23 3分钟，离心分钟，离心3000r/min3000r/min，5 5分钟，上清即为浓缩分钟，上清即为浓缩-球蛋白（或用冷冻干燥仪使其浓缩）。球蛋白（或用冷冻干燥仪使其浓缩）。 1 1、以醋酸纤维薄膜作为支持体的一种电泳方法。、以醋酸纤维薄膜作为支持体的一种电泳方法。2 2、在、在ph8.6ph8.6巴比妥缓冲液中，血清蛋白质在电场中巴比妥缓冲液中，血清蛋白质在电场中均带负电荷，向正极移动。均带负电荷，向正极移动。3 3、带电荷多、分子量相对小的泳动速度快；带电荷、带电荷多、分子量相对小的泳动速度快；带电荷少、分子量相对大的泳动速度慢。少、分子量相对大的泳动速度慢。 清蛋白清蛋白 1 2 加样线加样线加样线加样线纯化蛋白纯化蛋白对照对照样品样品 点样点样