重组人血小板生成素的研究与开发0502终稿

1、指导教师：胡昌华指导教师：胡昌华 教授教授辅助指导：赵燕莉辅助指导：赵燕莉 学姐学姐搜集整理资料：孙振鹏搜集整理资料：孙振鹏 赵丽丽赵丽丽翻译文献、校稿：赵娜薇翻译文献、校稿：赵娜薇 李娅男李娅男pptppt动画制作：赵振国动画制作：赵振国概述 大量存在于血液中无核盘状小细胞（直径约3m）。 其生成受血液中的血小板生成素(tpo)调节。成年人血液中血小板数量为1030万/mm3。 作用功能 促进止血; 加速凝血; 维护毛细血管壁完整性。血小板生成减少：血小板生成减少： 遗传性遗传性 获得性获得性血小板破坏增加：血小板破坏增加： 非免疫性非免疫性 免疫性免疫性其他：脾亢、出血等。其他：脾亢、出血

2、等。反复化疗更容易导致血小板减少血小板输注血小板输注u 存在的弊端主要有： 1）同种异体免疫反应：导致无效性血小板输注； 2）输血感染； 3）过敏反应； 4）来源困难，价格昂贵等。 因此，新型治疗血小板减少症的特效药物的研发具有较为可观的经济价值和深远的社会影响关于关于tpotpo和和rhtporhtpo研究历史和现状研究历史和现状主要生产方法及技术主要生产方法及技术参与竞争的主要公司参与竞争的主要公司目前存在问题及改进目前存在问题及改进前景与展望前景与展望巨核细胞tpo血小板生成素（内源性细胞因子）血小板生成素（内源性细胞因子） 与受体结合刺激增殖 分化 成熟血小板主要在肝脏合成；332个a

3、a、95kd的糖蛋白；两个结构域： 受体结合结构域； 富糖结构域。tpo受体受体（c-mpl） 含有2个细胞因子受体同源结构。 tpo与末端crm结合、激活c-mpl、启动细胞内信号转导1958年，kelemen等人发现在血小板减少症病人血浆中，存在一种可促进巨核细胞成熟及血小板生成的物质并命名为血小板生成素(tpo)。1994年，科学家采用反相及常规生物技术，从多个样本中纯化得tpo。 第1代tpo分子包括rhtpo、聚乙二醇化重组人巨核细胞生长衍生因子(peg-rhumgdf)。但由于临床试验中不良反应的存在, 第1代tpo分子在英美等发达国家已停止了研究，在国内得到一定程度的发展。进入2

4、1世纪以来，第2代tpo以其可口服给药，且相比第一代在免疫原性方面有所改善等优点被广泛研究。主要包括3类: tpo肽类模拟物、tpo非肽类模拟物和tpo激动剂抗体。它们以不同方式结合并激动tpo受体从而发挥生物学效应，部分正进行临床试验。(一)大肠杆菌表达系统 通过构建gst-tpo融合蛋白表达质粒，在tac启动子作用下实现了在tpo在原核细胞中的高效表达，再经gst亲和色谱及凝血酶酶切得到tpo目的产物。具有刺激巨核细胞和血小板生成的生物活性；表达水平较低；产物分离纯化技术尚未成熟。概述 以人胎肝cdna文库为模板，通过pcr引物设计、扩增使毕赤酵母信号肽序列取代tpo固有序列, 经电转化筛

5、获重组酵母,并用甲醇进行诱导表达。概述 将含有编码人血小板生成素核苷酸序列的cho细胞接种在细胞罐内扩增培养得到高表达收获液。然后通过一系列纯化工艺，获得高纯度和生物活性的rhtpo。评价适于rhtpo的大规模生产；终产物纯度较高；分离纯化表达产物的步骤过于繁琐。转化细胞转化细胞的筛选的筛选目的基因目的基因的扩增的扩增转染细胞目的转染细胞目的基因的检测基因的检测目的基因目的基因的获得的获得组建重组建重组质粒组质粒构建工构建工程细胞程细胞质量控制配制药品制剂目的产物的分离纯化培养工程细胞株add your textadd your textadd your textadd your text方法

6、与技术路线（下游阶段）go目的基因的获得（pcr）1. 模板变性模板变性 双链双链 dna 模板在模板在 95 c 变变性性为单链为单链 dna。2. 引物退火引物退火 引物与单链引物与单链 dna 互补并互补并退火。退火。3. 延伸反应延伸反应 耐热的耐热的 dna 聚合酶催化聚合酶催化子链的合成。子链的合成。back组建重组质粒b b质粒质粒a a质粒质粒pdc-t质粒质粒 王志云，等，西安医科大学学报，第22卷，第六期，2001back构建工程细胞u用磷酸钙介导的转染法进行转染用磷酸钙介导的转染法进行转染back磷酸钙介导的转染法back转化细胞的筛选 王志云，等，西安医科大学学报，第2

7、2卷，第六期，2001back目的基因的扩增 王志云，等，西安医科大学学报，第22卷，第六期，2001back转染细胞目的基因的检测 王志云，等，西安医科大学学报，第22卷，第六期，2001back培养工程细胞株细胞增殖细胞增殖rhtpo的的表达表达step step back目的产物的分离纯化经过经过sds-pagesds-page、hplchplc检测证明，种产品纯度检测证明，种产品纯度。浓缩脱盐浓缩脱盐阴离子阴离子交换层析交换层析疏水层析疏水层析凝胶凝胶过滤层析过滤层析back配制药品制剂back质量控制back沈阳三生制药股份有限公司历经近10年的潜心研发得出的药物“特比澳”（入选至国

8、家“863”计划、“十五”重大科技项目）曾于2005年5月获得国家一类新药证书，成为世界上第一个完成rhtpo临床试验并被批准上市的基因工程药物。rhtpo商品化药物的出现生产商生产商规格规格沈阳三生制药股份有限公司15000u/ml 3000u/ml 7500u/ml等吉巨芬（rhil-11）浙江杭州九源基因工程有限公司、齐鲁制药有限公司3mg（2.4107au）/支氨肽素丹东华盛生物制药有限公司每片0.2g复方皂矾丸陕西郝其军制药有限责任公司每丸0.2g醋酸泼尼松片每片5mg地塞米松天津天药药业股份有限公司每片0.75mg硫唑嘌呤片浙江奥托康制药集团股份有限公司每片50mg静脉注射用人免疫

9、球蛋白武汉瑞德生物制品有限责任公司、北京天坛生物制品股份有限公司有效成分igg含量为50g/l特比澳（rhtpo）与吉巨芬（il-11）两种药物的细化对比特比澳耐受性试验特比澳耐受性试验-单次给药单次给药参考文献参考文献 中国医学科学院学报中国医学科学院学报 2004 262004 26（4 4）:437-41:437-41减少血小板数恢复所需天数已实现商品化的药物（特比澳）存在的问题已实现商品化的药物（特比澳）存在的问题偶有发热、肌肉酸痛等；生产工艺复杂；终产物价格昂贵，多数阶层患者难以承受。第1代tpo相关分子聚乙二醇化重组人巨核细胞生长衍生因子，具有免疫原性，故而终止试验。 分离提取工艺方面； 生物活性的保证； 适当降低所需成本； 最优化治疗剂量、疗程的探讨。葛兰素史克公司正在研发的产品第二代tpo分子promacta，是口服非肽类血小板生成素受体激动剂，临床前和前两期临床研究显示本品可升高血小板数目。 其他