基因组提取 16S RNA PCR及连接转化

1、一、实验材料菌种：某浸矿混合菌。设备：eppendorf管、移液枪、台式高速离心机、电泳仪、水浴锅、PCR仪、无菌操作台、牙签、枪头、酒精灯。试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒、LB液体培养基、LB固体平板培养基、TE缓冲液（pH 8.0）、切胶回收试剂盒、Taq DNA polymerase，10 mM dNTPmix，引物，双蒸水，琼脂糖、溴乙锭EB、电泳缓冲液（50×TAE电泳缓冲液：取Tris 24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA（pH8.0） 20ml，加蒸馏水至100ml）、pGM-T 克隆试剂盒、Hind III、石蜡。二、实验步骤1 细菌基因组DN

2、A提取1.1 样品收集菌种培养至OD600为1-1.5，此时1 mL 菌液中约含1.0×109细胞，用灭过菌的1.5mL离心管去菌液1 ml，室温10,000 rpm离心1 min，收集菌体。1.2 基因组DNA的提取（使用前先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积参照瓶上的使用说明。）1.向菌体沉淀中加入200 l 缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮；2.向管中加入20 l 蛋白酶K溶液，混匀；3.加入220 l 缓冲液GB，振荡15秒，70放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；若溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA

3、不纯；4.加入无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；6.向吸附柱CB3中加入500 l 缓冲液GD，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3 放入收集管中； 7.向吸附柱CB3中加入700 l 漂洗液PW，12,000 rpm 离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；8.向吸附柱CB3中加入500 l 漂洗液PW，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管

4、中；9.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 l 洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000 rpm 离心2分钟，将溶液收集到离心管中。为了增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12,000 rpm离心2分钟。洗脱缓冲液体积不应少于50 l，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将

5、水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率，且DNA产物应保存在-20，以防DNA降解。1.3 DNA检测配置0.8%的琼脂糖凝胶，点样5l ,约80V 电泳20-30分钟，置于凝胶成像系统或紫外投射检测仪上观察条带。具体步骤如下：1制胶（80ml）：称取0.64g琼脂糖，加入80ml 的1×TAE缓冲液（pH8.0），摇匀；微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）；将胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50）加入5.0 l EB 后，混均匀，倒入其中，直至厚度为4-6mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固（约30-45min）。将制胶

6、板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。2 点样：用微量移液器将5l含蓝色染液的Marker加入点样孔下部，样品与Loading Buffer混匀后进行点样。3 电泳：打开电源开关，调节电压至3-5V/cm(约80V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约20-30min后即可观察结果。4 观察：将电泳好的胶置于紫外投射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。2 16s rDNA PCR扩增1 在冰盒上操作，按从大体积到小体积的次序将各成分加入一无菌PCR管中。试剂体积/l10×PCR Buffer 2.5dNTPs1引

7、物10.5引物20.5DNA模板2Taq 酶（2U/l1dd H2O 15.5Mgcl2 22 调整好反应程序，将上述混合液混匀，立即置PCR仪上，执行扩增。PCR反应程序如下：94 5 min94 45 s32 cycles55 45 s72 90 s72 5 min反应结束，PCR产物放置于4待电泳检测或-20长期保存。2.3 琼脂糖凝胶电泳检测1 制胶（80ml）：称取0.8g琼脂糖，加入80ml 的1×TAE缓冲液（pH8.0），摇匀；微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）；将胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50）加入5.0 l EB 后，混

8、均匀，倒入其中，直至厚度为4-6mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固（约30-45min）。将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。2 点样：用微量移液器将5l含蓝色染液的Marker加入点样孔下部，样品与Loading Buffer混匀后进行点样。3 电泳：打开电源开关，调节电压至3-5V/cm(约100V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约30-40min后即可观察结果。4 观察：将电泳好的胶置于紫外投射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的

9、相对位置初步估计样品的分子量。3 连接及转化由于前天未得到PCR产物，故采用实验室以前扩增的样品。3.1 连接1 将载体在冰上融化（尽可能避免反复冻融载体，在初次使用时最好分装成小份，每次使用时取出一份），短暂离心装有载体的离心管，以免液体挂在管壁上。2 按照下表内容在无菌的离心管中加入各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，可根据DNA片段的浓度及载体与片段分子大小来计算其摩尔比。加入过多的片段反而会干扰连接反应。使用2×Rapid Ligation Buffer连接体系中的成分反应体系对照体系目的PCR片段3 l-对照片段（700bp，50 ng/l）-1 lpGM-T

10、 载体（约50 ng/l）1 l1 l2×T4 DNA Rapid Ligation Buffer5 l5 lT4 DNA Ligation(3U/l)1 l1 l无菌去离子水补足到10 l补足到10 l3 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。将混合反应液置于22-26反应5-10 分钟（反应不要超过15min，否则会降低连接效率），反应结束后，将离心管置于冰上。3.2 转化1 取部分连接产物加到50-100 l TOP 10感受态细胞中（感受态细胞应刚从-70冰箱取出放于冰浴上，待刚刚解冻时加入连接产物，连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的十分之一），轻弹混匀，冰浴30分钟（必

11、要时使用超螺旋质粒pUC 19同步转化感受态细胞作为对照检测转化效率，将1l pUC 19加入另一只感受态细胞管中，其余操作步骤与连接产物的转化步骤同步进行）。2 将离心管置于42水浴90秒，取出管后立即置于冰浴中放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。3 向离心管中加入250-500 l 37预热的SOC或LB（不含抗生素）的培养基，150 rpm、37振荡培养45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。4 将离心管中的菌液混匀，吸取400 l加到含相应抗生素的LB固体琼脂平板培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开，待平板表面干燥后，倒置平板，37培养12-16小时。4

12、单酶切1 在一已灭菌的PCR管中依次加入下面体系（目的DNA为实验室先期提取），整个操作在在冰上操作。试剂体积/l10×Buffer1目的DNA片段5Msp0.2ddH2O3.8混匀，短暂离心。2 将其放入37水浴2-3小时。3 70水浴10分钟，终止酶切反应。4 琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。三、实验结果及分析1 细菌基因组DNA提取由于时间有限，提取总DNA后，先做16s rDNA PCR，然后做琼脂糖凝胶电泳检测。紫外投射检测仪上琼脂糖凝胶上没有任何条带，这表明没有提取出来基因组。此结果说明下一步的实验16s rDNA PCR将会失败。因此，我们以示意图1-1表示基因组DNA的凝

13、胶电泳图。图1-1 基因组DNA凝胶电泳示意图经查阅资料及讨论分析，该实验的失败应该与实验操作有关，现将有关注意事项列出：1.无菌操作应加强，所有器皿、枪头等都要经过灭菌，整个操作流程要带一次性手套，否则提出的DNA会被污染。2.尽量使用新鲜的菌体，大肠杆菌培养时间不宜过长，一般在12-16h之间，保证提取的基因组DNA不被降解。3.操作过程中某些环节力度应适当，如.加入GA之后一定要剧烈地振荡，使细胞壁彻底被破坏。但是后续过程中动作过大会造成DNA片段断裂成小片段。4.加入无水乙醇后，可能会出现絮状沉淀，应将离心管内的溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中，确保基因组DNA的得率。5.彻底晾干DNA，

14、防止漂洗液中的乙醇残留会影响后续的酶反应。2 16s rDNA PCR扩增实验PCR正如之前所料，没有扩增出产物，紫外投射仪下没有任何条带。这里用示意图1-2表示PCR扩增产物的凝胶电泳图。图1-2：16s rDNA PCR扩增凝胶电泳示意图经查阅资料及讨论分析，总结16s rDNA PCR扩增应该注意的相关事项：1.操作流程要在超净工作台下操作，加样量要足，不能有污染；2.配体体系所用的酶、dNTP、引物不能在常温下放置过久，否则可能导致降解；3.体系中不能含有抑制酶作用的物质，否则导致扩增不出产物。4.体系中的循环温度应该设置合理，确保每个过程都能完好的完成。3 连接、转化平板上有蓝白斑出现，但数量不多，原因可能是稀释的倍数过多，转化后的感受态细胞浓度不够大。图1-3为连接转化后的蓝白斑筛选平板。（手机像素不高，不是特别清晰。）图1-3 蓝白斑筛选平板图（红色箭头显示蓝斑，黑色箭头显示白斑）总结在做细胞转化时应注意以下几点：1所有操作均应在无菌条件和冰上进行。2所使用的器皿必须彻底灭菌，痕量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。3用于转化的应