《酶工程与技术》郭勇 第二版 知识点大全

1、酶工程原理与技术（概论）第1章 绪论1、酶的概念：具有生物催化功能的生物大分子。 2、酶的来源：适宜的细胞，在人工控制条件的生物反应器中生产各种所需的酶。 3、主要目标：经过预先设计，通过人工操作，获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其催化功能。 4、酶分类可采用4位标码： 第一位：属于六大类中的哪一类；第二位：属于该大类中的哪一亚类；第三位：该亚类中的哪一小类：第四位：具体酶在该小类中的序号。 5、六大类酶： （1） 氧化-还原酶 ：氧化-还原酶催化氧化-还原反应。 主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。另有过氧化物酶，氧合酶，细胞色素氧化酶等 （2）

2、转移酶 ：转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。 （3） 水解酶 ：水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 （4） 裂合酶：它能催化一个分子分成两个或多个分子，当然也可将两个或多个分子变成一个分子。裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。 （5） 异构酶：异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。 与转移酶不同，异构酶催化的是分子内部的基团转移。（6） 合成酶 ：又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这

3、类反应必须与ATP分解反应相互偶联。 特点是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需要金属离子辅助因子。 6、核酸类酶的分类与命名： 核酶本身是一种RNA，但它可特异性催化某个反应，特别是识别和剪切RNA的某个位点。 据酶催化反应的类型分为：剪切酶、剪接酶、多功能酶 据酶催化的底物分为：分子内催化（自我剪切酶、自我剪接酶）、分子间催化（RNA剪切酶、DNA剪切酶、多糖剪接酶、多肽剪切酶、氨基酸酯剪切酶、多功能R酶） 7、酶分析 ：以酶为分析对象，目的是检测食品、药物体液等生物样品中酶的含量或活性。 8、酶分析包括两种类型： 一是以酶为分析对象的分析，即一般所说的“酶活力测定”； 二是以

4、酶为分析工具或分析试剂的分析，称为“酶法分析”。 前者的目的在于检测生物样品中某种酶的含量或活性； 后者则主要用于测定与生物学有关样品中酶以外其他物质的含量。 （1）原理：都是利用酶的专一性、高效催化反应，通过酶反应速度的测定而检测相应的含量；在方法上也都有一个选择适宜反应条件和测定方法，以获得准确可靠的结果的问题。 酶法分析：是一种以酶为分析工具（分析试剂）的分析法，分析的对象可以是底物、辅酶、活化剂、酶抑制剂。主要用于测定与生物样品有关的样品中酶以外其他物质的含量。 酶活力：是指酶催化一定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下酶所催化的反应初速度。（单位时间底物减少或产物增加）. （2）酶

5、活力的测定通常包括两个阶段： 首先在一定的条件下，酶与底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物的变化量。 一般经过如下几个步骤：据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配置成一定浓度的底物溶液； 据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件； 在一定的条件下，将一定的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间； 反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。 (3) 终止酶反应的方法很多，常用的有： 反应时间一到，立即取出适量反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活 加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶变性失活 加

6、入酸或碱溶液，使反应液的pH值迅速远离催化反应的最适pH值而使反应终止 将取出的反应液立即置于低温冰箱或冰粒堆中，使反应液的温度迅速降低至10以下而终止反应。 9、有两种酶活力的标准单位P17： 开特（kat）:是酶活力的国际单位（SI），它规定在特定的体系下，反应速度为每秒转化1mol 底物所需的酶量 在两种不同的酶活力单位之间换算：1Kat = 6X 107 U 酶的一个活力单位：在该酶的最适条件下，在250C，一分钟内催化1mmol(微摩尔）底物的酶量。 比活力：特定条件下，单位重量酶活力：是指在一定条件下，酶所催化的反应初速度 （mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。是酶纯度的量度

7、，在酶的纯化过程中它的比活力增高，当酶提纯时，其比活力成为极大和恒定的值。 酶活力(或总活力)涉及在样品中酶的总单位，而比活力是每毫克蛋白质中酶单位的数量（U/mg） 10、测定酶活力的基本要求： （1）要使反应系统中除待测酶浓度是影响反应速度的唯一限制性因素（反应速度定量酶活力）； （2）其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大能力）； 11、测定条件选择： （1）底物种类选择：最适底物 a）对于绝对专一的酶无可选择；若相对专一则选Km最小的底物，即所谓最适底物；一般选工作底物； b）要求反应前后有可测定的理化性质变化 c）稳定 浓度选择： a） s>=100Km； b） 有时不宜采用

8、高底物浓度（有毒性、价高、溶解度小、抑制酶反应等)则根据具体条件，通过实验选一适当浓度。 （2） 最适pH a）选择最适pH并维持在这一范围。 b）pH稳定常借助缓冲系统来控制，要求稳定、无干扰、价廉。 c）离子种类和强度。 （3） 最适温度 酶反应温度系数为每变化 1 摄氏度，反应速度相差10%以上。 所以测酶活力时温度保持恒定十分重要，一般应控制在正负1摄氏度以内。 多数哺乳动物的酶，其最适温度为37左右，但有些生物机体的酶适应在极端条件下起催化作用，这些酶称极端酶。 （4） 样品 对某一待测样品测定前,除了上述因素需考虑外，还要确定样品中有无干扰测定结果的因素（与待测酶作用同一底物或生成

9、同一产物的其它酶）。 下面介绍几种常用的测定方法： 化学法:是取样法的一种,比较古老,但目前仍普遍使用。一是因为此法不需要特殊仪器，而且几乎所有的酶反应都可以根据产物或底物的化学性质找出具体的有特异性的测定方法。（工作量大、误差大、不够准确） 光学法：它是一种连续测定法，是根据底物和产物在某一波长或波段上有明显特征吸收差别而建立起来的方法。（灵敏度高、快速、简便）。 光学法又可分为三种：光吸收法；荧光法；旋光测定法。 光吸收法：这是几乎所有氧化还原酶都可采用的方法。 许多酶本身不能采用光吸收法，但其产物中有脱氢酶底物，则因此可用酶偶联进行测定。 荧光法：其原理是酶反应的底物或产物具有荧光性，用

10、荧光变化速度即可测出反应速度。荧光法的灵敏度比光吸收法高2-3个数量级，特别适于酶或底物量低的分析。但荧光法干扰多，需要校正。 旋光测定法：某些酶反应过程中常伴随有底物或产物旋光性质变化。可用自动旋光仪来测定这类酶的反应。此法准确度、灵敏度不高，不方便，但在没有其它更好的方法时，可考虑采用此法。 电化学法:也是一类连续测定法，其灵敏度和准确度都很高，可和光学法相比；而且测定系统被污染也不会影响结果，主要用电极进行测定，常用的是离子选择性电极和氧电极。 气体检测法:主要用于有气体吸收或释放的反应，如氧化酶反应耗气、脱羧酶、脲酶等催化的产气反应。常用瓦氏呼吸仪测定恒定体积内压力变化。此法主要缺点是

11、准确度、灵敏度不高，操作麻烦。 放射化学测定法:测定时用同位素标记底物，在酶反应进行中，导致放射性标记产物定量形成，分离产物与底物，进行产物的放射性测定或未反应底物的放射性测定，这样就可测知反应进行的速度或酶的活性。 酶偶联分析法:某些酶本身不能应用上述几种方法测定时，则可偶联一个酶反应进行测定。 酶的转换数与催化周期： 酶的转换数(KP)，又称摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。 即每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数，是酶催化效率的一个指标，一般酶的转换数103 min-1 催化周期：转换数的倒数 固定化酶的活力测定：振荡测定法、酶柱测定法、连续测定法。 固定化酶的

12、概念：与水不溶性载体结合，在一定的空间范围内起催化作用的酶。 固定化酶的比活力测定：一般采用每克（g）干固定化酶所具有的酶活力单位数表示。 相对酶活力的测定：相对酶活力的高低表明了固定化酶应用价值的大小。 （1） 酶标免疫分析法：它是将免疫学方法的抗体、抗原专一且定量结合的特点和酶的高效专一催化特点有机地结合在一起建立的一种高度特异、灵敏的分析方法。 （2） 放射免疫分析：是用放射性同位素标记抗原Ag+，该抗原与未标记抗原Ag竞争结合抗体(Ab)结合位点时的能力相同，所以反应生成的Ag+Ab复合物与Ag的量呈负相关。 Ag+Ab的生成量可通过测定其放射活性得到，然后根据已知浓度抗原的标准曲线就

13、可以计算出样品中抗原浓度，这种分析方法称为放射免疫分析。 酶标免疫测定优点：不需要特殊复杂的设备和仪器;灵敏度高;重复性好;对健康无害（无放射污染）。 （3） 酶标免疫测定的几个操作问题： 酶的要求：专一性强、活性高；在标记测定储存条件下稳定； 测定方法简单、快速、灵敏；纯度高而价廉易得；在被测液中无干扰酶活性测定的因素。 酶的标记 （1） 标记方法：不影响酶活性和免疫活性、操作简便、产量高且稳定；现在最常用的是交联法特别是戊二醛交联法。 （2） 标记物纯化：酶标反应后必须除去未被标记的抗原或抗体以及未被结合的酶。 （3）免疫活性和酶活性测 免疫原的制备 特异性抗体制备 抗体固定定第一篇 酶的

14、生产生产方法1、 提取分离法 2、 生物合成法 3、化学合成法 第二章 酶生物合成的基本理论酶的生物合成及其调节酶的生物合成：通过细胞的生命活动合成各种酶的过程。酶有蛋白质类酶（P酶）和核酸类酶（R酶）两大类别，酶的生物合成主要是指细胞内RNA和蛋白质的合成过程。第1节 RNA的生物合成转录第2节 蛋白质的生物合成翻译第3节 酶的生物合成的调节第三章 酶的生物合成法生产第一节 产酶细胞的选择 酶生产的细胞必须具备的条件： 1、 酶的产量高 2、 容易培养和管理 3、 产酶稳定性好 4、 利于酶的分离纯化 5、 安全无毒 1、 微生物 基本要求： 1不是致病菌2发酵周期短,产酶量高3不易变异退化

15、 4最好是产生胞外酶的菌种,利于分离 5对医药和食品用酶,还应考虑安全性6由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验7非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。 第2节 培养基的配制 1、 培养基的基本成分 1、 碳源 大多数产酶微生物采用淀粉或其水解产物，如糊精、淀粉水解糖、麦芽糖、葡萄糖等为碳源。 植物细胞以蔗糖为碳源；动物细胞以谷氨酰胺或谷氨酸为碳源。 2、 氮源：有机氮源和无机氮源两大类。 不同的细胞对氮源有不同的要求： 动物细胞要求有机氮源；植物细胞主要使用无机氮源；微生物细胞中，异养型细胞要求有机氮源，自养型细胞采用无机氮源。 在使用无机氮源时要注意铵盐和硝酸盐的比

16、例 碳和氮两者的比例，即碳氮比（C/N），对酶的产量有显著影响。所谓碳氮比一般是指培养基中碳元素（C）的总量与氮元素（N）总量之比。 2、 培养基的设计原则 1、 选择适宜的营养物质 2、营养物的浓度及配比合适 3、物理、化学条件适宜 4、经济节约 5、精心设计、试验比较 3、 植物细胞培养基 1、 植物细胞培养基的特点 （1）植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐 （2）植物细胞需要多种维生素和植物生长激素，如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、生长素、分裂素等。 （3）植物细胞要求的氮源一般为无机氮源 （4）植物细胞一般以蔗糖为碳源 2、 常用的植物细胞培养基 MS培养基：硝酸盐浓度高，广泛应用于植

17、物细胞、组织和原生质体培养 B5培养基：铵盐浓度低，适于双子叶植物特别是木本植物的组织、细胞培养 White培养基：无机盐浓度低，适合生根培养 KM-8P培养基：有机成分种类全面，广泛应用与原生质体的培养 （一）动物细胞培养基的组分 1氨基酸：必需氨基酸、谷氨酰胺、谷氨酸 2维生素：无血清需补充VB、VC 3无机盐：调节渗透压 4葡萄糖： 5激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松 6生长因子：无血清需添加适量的表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子 （二）动物细胞培养基的配制 第3节 产酶工艺条件及其控制培养基中溶解氧的量决定于一定条件下氧气的溶解速度 氧的溶解速度又称为溶氧速率或溶氧系数

18、，以Kd表示。溶氧速率是指单位体积的发酵液在单位时间内所溶解的氧的量。其单位通常以 mmol氧/h·L表示。 溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。耗氧速率、细胞浓度的概念第4节 微生物发酵产酶 一、微生物发酵产酶的方式及其特点 固体培养发酵 液体深层发酵 固定化细胞发酵 固定化原生质体发酵 2、 提高酶产量的措施 1、 添加诱导物（诱导物的分类：酶作用底物型诱导物 酶的反应产物 酶作用底物类似物作诱导物 ） 酶最有效的诱导物往往不是酶的作用底物，也不是酶的反应产物，而是可以与酶结合又不能被酶催化的底物类似物。 2、 控制阻遏物浓度 3、

19、 添加表面活性剂 表面活性剂分为离子型和非离子型两大类 适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿(Triton)等可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。离子型表面活性剂对细胞有毒害作用 4、添加产酶促进剂 3、 酶发酵动力学 （1） 酶生物合成的模式；同步合成型 延续合成型 中期合成型 滞后合成型 中期合成型酶的共同特点是：酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用，而且酶所对应的mRNA稳定性差 滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成，主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏

20、解除后，酶才开始大量合成。若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的mRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。 在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式应是延续合成型。 对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始； 对于中期合成型的酶，则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成的开始时间提前， 并尽量延迟其生物合成停止的时间。 （2） 细胞生长动力学 1950年，法国的莫诺德(Monod)首先提出

21、了表述微生物细胞生长的动力学方程？ 莫诺德方程中的m 和KS可以通过双倒数作图法求出？ 宏观产酶动力学的研究表明：产酶速率与细胞比生长速率、细胞浓度以及细胞产酶模式有关。产酶动力学模型或称为产酶动力学方程可以表达为？ （1） 固定化细胞发酵产酶的特点 (1) 提高产酶率(2) 可以反复使用或连续使用较长时间(3) 发酵稳定性好，对温度、pH的适应范围扩大，基因工程菌的质粒稳定，不易丢失(4) 缩短发酵周期， 提高设备利用率(5) 产品易于分离纯化(6) 只适用于胞外酶等胞外产物的生产 固定化原生质体的特点 (1) 变胞内产物为胞外产物(2) 提高酶产率(3) 稳定性较好(4) 易于分离纯化 固

22、定化原生质体发酵产酶在工艺条件控制方面需要注意下列问题： (1) 渗透压的控制(2) 防止细胞壁再生(3) 保证原生质体的浓度 第五节 植物细胞培养产酶 1、 植物细胞的特性 与微生物相比：细胞大；生长速率、代谢速率低，倍增时间、生产周期长；营养要求简单；大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照强度和光照时间；对剪切力敏感；主要目的产物为色素、药物、香精和酶 第6节 动物细胞培养产酶 动物细胞主要用于生产疫苗、激素、多肽生长因子、酶：胶原酶、尿激酶等单克隆抗体、 非抗体免疫调节剂 1、 动物细胞的特性 没有细胞壁；适应环境的能力差，脆弱 细胞大；以集群形式存在，细胞培养中大部分细

23、胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性、功能全能性；营养要求复杂。第4章 酶的提取与分离纯化第一节 细胞破碎1、 机械破碎法2、 物理破碎法 （1、 温度差破碎法：热胀冷缩2、压力差破碎法：高压冲击法 突然降压法 渗透压变化法 超声波破碎法）3、 化学破碎法（有机溶剂 表面活性剂）4、 酶促破碎法 自溶法 溶菌酶、葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶等 第二节 提取酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非

24、极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 影响酶提取的主要因素 主要影响因素是酶在所使用的溶剂中的溶解度以及酶向溶剂相中扩散的速度。 此外，还受到温度、pH值、提取液体积等提取条件的影响 第3节 沉淀分离 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程 沉淀分离的方法主要有：盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法等 1、 盐析沉淀法 盐析沉淀法简称盐析法，是

25、利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。 而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析 盐之所以会改变蛋白质的溶解度，是由于盐在溶液中离解为正离子和负离子。由于反离子作用，使蛋白质分子表面的电荷改变，同时由于离子的存在改变了溶液中水的活度，使分子表面的水化膜改变 饱和度是指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值 饱和硫酸铵的配制方法： 过量硫酸铵50

26、60保温 趁热过滤0或25 平衡12天 有固体析出即为饱和硫酸铵溶液 2、 离心方法的选择 对于超速离心，可以根据需要采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。 1、 差速离心：差速离心是指采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。 2、 密度梯度离心 样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。 3、 等密梯度离心 当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围内时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒或向下沉降，或向上飘浮，只要时间足够长，就可以一直移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度点），形成区带。这种方法称

27、为等密梯度离心，或称为平衡等密度离心。等密梯度离心常用的离心介质是铯盐， 离心条件：离心机、离心方法、离心介质、密度梯度、离心力（或离心速度）和离心时间 第5节 过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。 根据过滤介质的不同, 过滤可以分为膜过滤和非膜过滤两大类。 根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤可以分为粗滤、微滤、超滤和反渗透等4 大类 第6节 层析分离 层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同比例分布在两相（固定相、流动相）中。 当流动相流经固定相时，各组分以不同

28、的速度移动，从而使不同的组分分离纯化。 分离纯化酶常采用：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等 1、 吸附层析 1、 吸附层析原理： 任何两个相之间都可以形成一个界面，其中一个相中的物质在两相界面上的密集现象称为吸附。 凡是能够将其它物质聚集到自己表面上的物质称为吸附剂。吸附剂一般是固体或者液体，在吸附层析中通常应用的是固体吸附剂。能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。吸附剂与被吸附物之间的相互作用力主要是范德华力。其特点是可逆的。 吸附层析通常采用柱型装置，先装柱、加液，而后洗脱 在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。 适当时间后，不同物质在吸附柱内形

29、成各自的区带 2、 洗脱方法 三种方法：溶剂洗脱法、置换洗脱法、前缘洗脱法 3、 吸附剂与洗脱剂的选择 吸附剂的选择：吸附层析的关键因素 极性物质容易被极性表面吸附；非极性物质容易被非极性表面吸附；溶解度越大的物质越难被吸附。吸附剂可分为无机吸附剂和有机吸附剂。吸附剂通常由一些化学性质不活泼的多孔材料制成，比表面积很大 洗脱剂的选择：要根据吸附剂的性质和被吸附物的特点来选择合适的洗脱剂。 对于极性组分，用极性大的溶剂洗脱效果较好。而对于非极性组分，则用非极性溶剂洗脱较佳。 洗脱剂的种类有：饱和烃、醇、酮、酚、醚、卤代烷、水等。 洗脱剂的选择要注意下列各点： 洗脱剂不会与吸附剂起化学反应，也不会

30、使吸附剂溶解。 洗脱剂对混合液中的各组分的溶解度大，粘度小，流动性好，容易与被洗脱的组分分离。 洗脱剂要求一定的纯度，以免杂质对分离带来不利影响 2、 分配层析 分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。 分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，分配系数是一常数，以K表示。 3、 离子交换层析 离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。 按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂 由于酶分子具有两性性质，所以可用

31、阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。 在溶液的pH值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂（引入碱性基团）进行层析分离； 4、 凝胶层析 又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术 1 、凝胶层析的基本原理 凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的 凝胶层析的操作一般包括装柱、上柱、

32、洗脱等过程 5、 亲和层析原理 6、 层析聚焦原理 （1） 电场强度是指每厘米距离的电压降。 （2） 溶液的pH值（3） 溶液的离子强度（4） 电渗第7节 电泳分离电泳：是指带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术。 电泳的基本原理：不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。 影响电泳的因素：主要取决于本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。 电泳方法按其使用的支持体的不同分为：纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、自由电泳、等电聚焦电泳

33、。 纸电泳：指用滤纸作为支持载体的电泳方法。 醋酸纤维素薄膜电泳：电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特点是分离速度快、电泳时间短、样品用量少。 凝胶电泳：具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。常用的凝胶为葡聚糖、交联聚丙烯酰胺和琼脂糖 与其他电泳的区别：凝胶电泳同时具有电泳和分子筛的双重作用。 凝胶电泳的特点：它具有机械强度好、弹性大、 透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小(1100g）、分辨率高等优点。 聚丙烯酰胺凝胶：单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-亚甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂N,N,N

34、,N-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶，通过改变凝胶浓度及交联度来调节凝胶的孔径，具有良好的分子筛效应。 第8节 萃取分离8.1有机溶剂萃取 用于萃取的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等。例如，用丁醇萃取微粒体或线粒体中的酶；用苯酚萃取RNA等。 由于有机溶剂容易引起酶蛋白和酶RNA的变性失活，所以在酶的萃取过程中，应在010的低温条件下进行，并要尽量缩短酶与有机溶剂接触的时间。 8.2双水相萃取 双水相萃取的两相分别为互不相溶的两个水相。 双水相萃取中使用的双水相一般由按一定百分比组成的互不相溶的盐溶液和高分子溶液或者两种互不相溶的高分子溶液组成。 在双水

35、相系统中，蛋白质、RNA等在两相中的溶解度不一样，分配系数不同，从而达到分离 8.3超临界萃取 超临界萃取又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术 物质在不同的温度和压力条件下，可以以不同的形态存在，如固体(S)、液体(L)、气体(G)、超临界流体(SCF)等。 目前在超临界萃取中最常用的超临界流体是CO2。 8.4反胶束萃取： 反胶束萃取是利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来的一种分离纯化技术。 反胶束，又称为反胶团，是表面活性剂分散于连续有机相中形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统 胶束与反胶束的形成

36、：将表面活性剂溶于水中，并使其浓度超过临界胶束浓度，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体。通常将在水溶液中形成的聚集体胶束，称为正胶束 如果将表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶束 反胶束系统萃取方法的基本过程是：首先在酶蛋白相转移最佳的条件下，将酶从水相中萃取到反胶束相中。第二步，在最佳条件下，将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相的，即将酶从有机相中提取出来。 最常用的是阴离子表面活性剂。 第9节 结晶 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。通常酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行

37、结晶 盐析结晶 有机溶剂结晶 透析平衡结晶 等电点结晶 第10节 浓缩与干燥 浓缩:从低浓度溶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓度溶液的过程。 干燥方法：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥 使酶催化特性得以改进的技术有很多，主要有：酶分子修饰(enzyme molecule modification)技术、酶固定化(enzyme immobilization)技术、酶的非水相催化(enzyme catalysis in non-aqueous phase)技术、酶的定向进化(enzyme directed evolution)技术等。第二篇 酶的改性第五章 酶改性的基本理论酶的结

38、构及其与催化特性的关系 第1节 酶的化学组成蛋白类酶的基本组成单位氨基酸核酸类酶的基本组成单位核苷酸第2节 酶的化学结构第3节 酶的空间结构第4节 酶的活性中心第5节 酶的结构与催化特性的关系第6章 酶分子修饰酶分子修饰的方法 第1节 酶分子的主链修饰 用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为酶分子主链修饰 1、 主链的切断修饰 主链切断后可能出现三种情况 （1） 酶中心被破坏，催化功能丧失（2） 催化功能保持不变或损失不多，抗原性降低 （3）有利于酶活性中心的形成，催化功能提高 多酶融合体：具有两种或多种催化活性的酶 双头酶：一条

39、主链具有两种酶活性的酶 第2节 酶分子的侧链基团修饰 采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。 侧链修饰的意义： 可研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响。可测定某一基团在酶分子中的数量；可提高酶活力、增加稳定性、降低抗原性、提高酶的使用价值； 可能获得新酶种 蛋白类酶和核酸类酶的侧链基团不同，修饰方法也有所区别。（1）酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。（2） 核酸类酶主要由核糖核酸（RNA）组成，酶RNA的侧链基团是指组成RNA

40、的核苷酸残基上的功能团。RNA分子上的侧链基团主要包括磷酸基，核糖上的羟基，嘌呤、嘧啶碱基上的氨基和羟基（酮基）等。 酶的侧链基团修饰方法主要有：氨基修饰，羧基修饰，巯基修饰，胍基修饰，酚基修饰，咪唑基修饰，吲哚基修饰，分子内交联修饰等。 大分子结合修饰的作用： (1)通过修饰提高酶活力(2) 通过修饰可以增强酶的稳定性(3) 通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性 第3节 酶的组成单位置换修饰 1、 酶分子组成单位修饰的作用 1、 通过修饰可以提高酶活力2、 通过修饰可以增强酶的稳定性3、 通过修饰可以使酶的专一性发生改变4、 通过核苷酸置换修饰可以获得各种人造核酸类酶 氨基酸或核苷酸的置换修饰现

41、在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。 定点突变是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。点突变技术用于酶分子修饰的主要过程：1、 新的酶分子结构的设计（基因序列分析、蛋白质结构分析、酶活性中心分析）2、 突变基因碱基序列的确定3、 突变基因的获得（引物设计进行基因定点突变PCR技术）4、 新酶的获得（酶基因克隆表达、变异特性分析） 第4节 酶的金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。 酶分子中所含金属离子往往是酶活性中心的组成部分

42、。若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。 第5节 酶分子的物理修饰 酶修饰后的性质变化 热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。 抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。 各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。 半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。 最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，修饰酶最适pH更接近于生理环境。 Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显

43、变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。第7章 酶分子定向进化酶的定向进化：又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。 定向进化的原理：在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有3->5校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 DNA改组和外显子改组 DN

44、A改组又称有性PCR(sexual PCR)：该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。通过DNA改组, 不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体。 外显子改组：类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物。在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。与DNA改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。定向进化的选择策略： （1） 定向进化中，突变具有随机性，但通过选择

45、特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类， 降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。 （2） 通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。第8章 酶固定化酶在生产实践中的一些不足之处： （1） 酶的稳定性较差（2） 酶的一次性使用（3） 产物的分离纯化较困难 固定化酶的优缺点 优点： (1)极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺. (2)可以长时间、反复使用，有利于工艺的连续化、管道化 (3)酶反应过程可严格控

46、制，有利于工艺自动化和微电脑化。 (4)在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。 (5)较能适应于多酶反应。 (6)酶的使用效率、产物得率提高，质量有保障，成本低。 缺点： (1)酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。 (2)比较适于水溶性底物和小分子底物。 (3)与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应。 (4)对胞内酶需经分离后才能固定化。 第1节 固定化方法 （1） 五大类方法： 吸附法 结合法 交联法包埋法 热处理法 （2） 选择方法依据： 1、 酶的性质 2 、载体的性质 3 、制备方法对酶的影响 （3） 固定化后酶的考察项目： 1 、测定固

47、定化酶的固定化率以及酶活力回收率。 2 、考察固定化酶稳定性 3 、考察固定化酶最适反应条件 酶的固定化方法 （一） 吸附法 利用各种固体吸附剂作为载体将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法称为物理吸附，又简称吸附法。 选择载体的原则： （1）要有巨大的比表面积（2） 要有活泼的表面（3） 便于装柱进行连续反应。 物理吸附法常用的固体吸附剂有： 活性炭 氧化铝 硅藻土 多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、硅胶 羟基磷灰石、 金属丝网等 影响吸附的因素主要有： 酶分子表面的电荷 介质中离子强度 pH 温度 蛋白质浓度及酶和载体的特性 酶分子表面的电荷 通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷

48、，能有效的克服固定化酶的解吸作用。 吸附法的优点 ： 操作简单、条件温和。可选择的载体种类多。吸附过程可以同时纯化酶。固定化酶在使用过程失活后可重新活化。载体可以回收再利用。 吸附法的缺点：某些吸附过程的机理还不是十分明了，在给酶量、吸附程度以及固定化酶活力回收等方面的不可预见性大。易脱落，影响产物纯度和酶的操作稳定性。 （2） 包埋法1、凝胶包埋法 载体： 琼脂凝胶 海藻酸钙凝胶 角叉菜胶 明胶 聚丙烯酰胺凝胶 2、 半透膜包埋法 常用半透膜：聚酰胺膜 火棉胶膜 包埋法的特点 优点：包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶。对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的

49、微生物细胞都是适用的。 不足：只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜；同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。 (3) 结合法 选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。 1、 离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法 所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 2、 共价键结合法： 所用载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。 重氮法 叠氮反应 3溴化氰法 烷基化法（4） 交

50、联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。 （5） 热处理法 将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。 热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活 第2节 固定化酶的特性 1、 稳定性 二、最适温度 三、最适pH值 四、底物特异性 第3节 固定化技术的应用 世界上第一种工业化生产的固定化酶氨基酰化酶。 世界上生产规模最大的一

51、种固定化酶葡萄糖异构酶。 酶传感器：酶传感器是由固定化酶与传感元件两部分组成的，其中酶是与适当的载体结合形成的不溶于水的固定化酶膜。 最常用的酶传感器是酶电极，即将固定化酶膜与转换电极做在一起，当酶膜与被测物发生催化反应而生成电极活性物质后，电极测定活性物质并将其转换为电信号输出。 酶电极：是由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置。酶电极一般可根据电极检测物理量的不同分为电流型和电压型，前者一般有氧电极、H2O2电极等，后者有NH3、CO2、H2电极等。 较典型的一种酶电极为葡萄糖酶电极。 葡萄糖酶电极的敏感膜是葡萄糖氧化酶（GOD），它被固定在聚乙烯酰胺凝胶上。在酶膜的作用下葡萄糖发生氧化反

52、应，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和过氧化氢。通过用电极测量被消耗的氧或生成的过氧化氢就可了解葡萄糖浓度。第9章 酶非水相催化非水介质：有机溶剂介质，超临界流体介质，气相介质，离子液介质等 1、 有机介质中的酶催化 有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。 适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。 酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。 2、 气相介质中的酶催化 气相介质中的酶催化是指酶在气相介质中进行的催化反应。 适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。 由于气体介质的密度低，扩散容易，所以酶在

53、气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点 3、 超临界流体介质中的酶催化 超临界介质中的酶催化是指酶在超临界流体中进行的催化反应。 用于酶催化反应的超临界流体应具有的特点 对酶的结构没有破坏作用，对催化作用没有明显的不良影响； 具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性； 超临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或在酶催化的最适温度附近； 超临界压力不能太高，可节约压缩动力费用； 超临界流体要容易获得，价格要便宜等 4、 离子液介质中的酶催化 离子液介质中的酶催化是指酶在离子液中进行的催化作用。 离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下

54、呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点 非水相介质中酶催化的特点 1、 可以将加水分解反应转为其逆反应 2、酶的热稳定性高 3、容易回收和反复利用 4、改变酶对底物的专一性 5、提高有机化合物（尤其是非极性底物）的溶解度 6、低沸点溶剂中可容易分离纯化产物 7、能抑制依赖于水的某些不利反应 8、没有微生物的污染 9、非水系统中酶不易脱离吸附表面，易于酶的固定化 胶束又称为正胶束或正胶团，是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂包在液滴内部。反应时，酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶束内部。反应在胶束的两相界面中进行。 反胶束又称为反胶团，是指在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液，加入表面活性剂后形成的油包水的微小液滴。表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，水溶液包在胶束内部。反应时，酶分子在反胶束内部的水溶液中，疏水性底物或产物在反胶束外部，催化反应在两相的界面中进行 第2节 水对非水相介质中酶催化的影响 酶在完全非水