有机酸测定PPT课件

1、 果实酸味的强弱，并非决定于酸的总含量，而是果实酸味的强弱，并非决定于酸的总含量，而是决定它的酸碱值的高低，决定它的酸碱值的高低，即氢离子的离解度大小，氢即氢离子的离解度大小，氢离子愈多则愈酸。不过果实中含有各种缓冲物质，如离子愈多则愈酸。不过果实中含有各种缓冲物质，如蛋白质、氨基酸等成分，能起一定的缓冲作用。但当蛋白质、氨基酸等成分，能起一定的缓冲作用。但当果实或果汁加热或煮熟时，由于蛋白质凝固，失去了果实或果汁加热或煮熟时，由于蛋白质凝固，失去了缓冲作用，同时因温度升高，也促进酸的离解，则氢缓冲作用，同时因温度升高，也促进酸的离解，则氢离子增加使得果实酸味增大。离子增加使得果实酸味增大。第

2、1页/共68页 由于酸的种类不同，氢离子的离解度的大小也由于酸的种类不同，氢离子的离解度的大小也有很大差别，如酒石酸较柠檬酸和苹果酸的酸味大。有很大差别，如酒石酸较柠檬酸和苹果酸的酸味大。一般果实中含酸在一般果实中含酸在0.10.5%时，感觉比较适口，含时，感觉比较适口，含酸在酸在0.51%时，便觉酸味较浓。时，便觉酸味较浓。 各种有机酸在果实组织中以游离或盐式状态存各种有机酸在果实组织中以游离或盐式状态存在。例如，在。例如，甜橙甜橙所含柠檬酸大约有所含柠檬酸大约有50%50%呈游离态，呈游离态，40%40%为柠檬酸钾盐，为柠檬酸钾盐，10%10%为柠檬酸钙盐。为柠檬酸钙盐。第2页/共68页

3、在同一种果实中，其所含的有机酸并非是单纯某在同一种果实中，其所含的有机酸并非是单纯某一种，往往数种同时存在。但在分析测定果实中的含一种，往往数种同时存在。但在分析测定果实中的含量时，多以果实所含的主要有机酸种类为计算标准。量时，多以果实所含的主要有机酸种类为计算标准。如柠檬酸含于柑橘类、石榴、凤梨等果实中；苹果酸如柠檬酸含于柑橘类、石榴、凤梨等果实中；苹果酸主含于仁果类、核果类；酒石酸为葡萄的主要有机酸，主含于仁果类、核果类；酒石酸为葡萄的主要有机酸，故也称为葡萄酸故也称为葡萄酸. .第3页/共68页 新鲜果实及其加工品的风味，主要决定于糖分和新鲜果实及其加工品的风味，主要决定于糖分和酸分的比

4、例（简称糖酸比）。在加工过程中，酸分的酸分的比例（简称糖酸比）。在加工过程中，酸分的存在可以促使蔗糖的转化和果胶物质的水解，还能与存在可以促使蔗糖的转化和果胶物质的水解，还能与金属化合而影响制品的风味和色泽。在处理高酸分的金属化合而影响制品的风味和色泽。在处理高酸分的果实时，对于所用的器械、用具和仪器，最好是非金果实时，对于所用的器械、用具和仪器，最好是非金属的。属的。 氢离子的存在对微生物的活动是非常不利的，可氢离子的存在对微生物的活动是非常不利的，可以降低微生物的致死温度，一般果实以降低微生物的致死温度，一般果实pHpH值为值为2.5-5.02.5-5.0之间，加热至之间，加热至10010

5、0后便能达到杀菌的效果。后便能达到杀菌的效果。第4页/共68页 糖和有机酸是果汁中主要的风味营养物质，其含糖和有机酸是果汁中主要的风味营养物质，其含量高低与果汁制品的品质有密切的关系。因此，量高低与果汁制品的品质有密切的关系。因此，糖和有机酸含量的测定是国内外果汁生产企业极糖和有机酸含量的测定是国内外果汁生产企业极为关注的问题之一。为关注的问题之一。 植物体内有机酸含量分析是近几年来研究的热点植物体内有机酸含量分析是近几年来研究的热点, ,尤其是在逆境生理方面，果实中有机酸种类与含尤其是在逆境生理方面，果实中有机酸种类与含量也是衡量果实品质的重要指标。量也是衡量果实品质的重要指标。第5页/共6

6、8页 有机酸在食品的加工、贮存、品质管理、评价以有机酸在食品的加工、贮存、品质管理、评价以及生物化学等领域，被认为是重要的成分及生物化学等领域，被认为是重要的成分，要求，要求对农产品中的总酸量、特定的有机酸进行定量，对农产品中的总酸量、特定的有机酸进行定量，以及分析全部有机酸的组成。以及分析全部有机酸的组成。 综上所述综上所述, ,酸度对农产品、食品和饮料酸度对农产品、食品和饮料, ,酒类以及酒类以及发酵产品有着重要的作用发酵产品有着重要的作用, ,并且并且, ,影响酸度的影响酸度的有机有机酸又是农产品、食物和酒中重要的呈味成分酸又是农产品、食物和酒中重要的呈味成分, ,是一是一类重要的分析项

7、目类重要的分析项目。第6页/共68页 人们在味觉中的酸度，主要不取决于酸的总量，人们在味觉中的酸度，主要不取决于酸的总量，而是取决于离子状态的那一部分酸而是取决于离子状态的那一部分酸( (游离酸游离酸) )，一，一般以氢离子浓度般以氢离子浓度(pH(pH值值) )来表示，称为有效酸度。来表示，称为有效酸度。测定测定pHpH值的方法很多，其中以值的方法很多，其中以pHpH计较为准确、简计较为准确、简便。各种有机酸的分离和定量。通常用柱层析法、便。各种有机酸的分离和定量。通常用柱层析法、纸层析法、气相色谱法和羧酸分析仪法。纸层析法、气相色谱法和羧酸分析仪法。第7页/共68页 常规的酸度分析包括总酸

8、度常规的酸度分析包括总酸度( (可滴定酸度可滴定酸度) )、有效、有效酸度酸度( (氢离子活度、氢离子活度、pHpH值值) )和挥发性酸。和挥发性酸。 总酸度即可滴定酸度总酸度即可滴定酸度, ,它简单，实用，总酸度是所它简单，实用，总酸度是所有酸性成分的总量，通常用标准碱来测定，并以酚有酸性成分的总量，通常用标准碱来测定，并以酚酞指示剂指示其滴定终点酞指示剂指示其滴定终点, ,以此进行定性、定量分以此进行定性、定量分析析, , 是一种强碱弱酸的中和滴定反应是一种强碱弱酸的中和滴定反应; ;并以样品中并以样品中所含主要酸的质量分数所含主要酸的质量分数( () )表示。表示。第8页/共68页 但有

9、的农产品由于缓冲作用和色素的影响，往往但有的农产品由于缓冲作用和色素的影响，往往难以判断滴定终点难以判断滴定终点，在这种情况下，可以，在这种情况下，可以使用使用电电位滴定法位滴定法。代表了样品中所含各种酸的总和。代表了样品中所含各种酸的总和, ,而不而不能全面地准确地表达农产品中所含各种酸的确切能全面地准确地表达农产品中所含各种酸的确切的含量的含量。第9页/共68页 挥发酸的分析也属于此类强碱弱酸的中和滴定，挥发酸的分析也属于此类强碱弱酸的中和滴定，农产品中的多种有机酸可根据它们的沸点高低分农产品中的多种有机酸可根据它们的沸点高低分为挥发性和不挥发性酸为挥发性和不挥发性酸, ,常规的总酸测定结

10、果中包常规的总酸测定结果中包含了挥发酸的含量，在含了挥发酸的含量，在挥发酸的分析中挥发酸的分析中, ,通过加热通过加热样品蒸馏分离后样品蒸馏分离后, ,便可在分析中测定出农产品中所便可在分析中测定出农产品中所含挥发酸的含量含挥发酸的含量, ,这种挥发酸以蚁酸计。这种挥发酸以蚁酸计。第10页/共68页 总酸度，挥发酸和有效酸度的总酸度，挥发酸和有效酸度的pHpH值都是酸度的表达值都是酸度的表达方式方式, ,它们之间有一定的内在联系它们之间有一定的内在联系, ,即即都表示了被测都表示了被测物中酸度的大小物中酸度的大小, ,但是但是, ,它们在含义上却有不同之处，它们在含义上却有不同之处，酸度中的总

11、酸度的测定都是在测定过程中酸度中的总酸度的测定都是在测定过程中, ,被检样被检样品中的酸性成分和强碱的氢氧化钠标准液进行中和品中的酸性成分和强碱的氢氧化钠标准液进行中和反应反应, ,定量地得出其中含酸成分的大概含量定量地得出其中含酸成分的大概含量( (因都以因都以所含主要有机酸计算的所含主要有机酸计算的),),这些酸的成分不管它们的这些酸的成分不管它们的酸性强弱酸性强弱, ,氢离子离解度的大小氢离子离解度的大小, ,都同样在强碱弱酸都同样在强碱弱酸的中和滴定中反映到测定结果中。的中和滴定中反映到测定结果中。第11页/共68页 而而有效酸度中的有效酸度中的pHpH值却只表示了被测样品中氢离值却只

12、表示了被测样品中氢离子浓度的大小子浓度的大小，相同总酸度的不同样品中，相同总酸度的不同样品中, ,由于由于所含的酸的种类不同所含的酸的种类不同, ,从理论上讲从理论上讲, ,它们的它们的pHpH值也值也会有所差异。会有所差异。 而而挥发酸的测定挥发酸的测定, ,却比较真实地反映了样品中低却比较真实地反映了样品中低沸点的蚁酸含量的多少沸点的蚁酸含量的多少, ,不能概括样品中其它多不能概括样品中其它多种沸点较高的有机酸的含量和样品种沸点较高的有机酸的含量和样品pHpH值的高低。值的高低。第12页/共68页 滴定法只能测定食品的总酸度，滴定法只能测定食品的总酸度，不能具体反映出不能具体反映出有机酸的

13、种类和含量有机酸的种类和含量，所需费用较低，所需费用较低, ,但影响因但影响因素较多素较多, ,准确度差。准确度差。 比色法只能测定单一的有机酸。比色法只能测定单一的有机酸。 薄层色谱法一次可测定多种有机酸薄层色谱法一次可测定多种有机酸, ,但测量精度但测量精度差差, ,可以定性可以定性, ,不适合定量不适合定量。第13页/共68页 气相色谱法仅适于测定其中的挥发性有机酸气相色谱法仅适于测定其中的挥发性有机酸, ,常常因有机酸的沸点较高，不易气化而需要先对其因有机酸的沸点较高，不易气化而需要先对其衍衍生生再进行测定，方法繁琐，再进行测定，方法繁琐，难以用于热稳定性差难以用于热稳定性差和含量极低

14、的有机酸分析和含量极低的有机酸分析; ;同时又因有机反应不同时又因有机反应不易定量进行而直接影响测定结果的准确性易定量进行而直接影响测定结果的准确性。第14页/共68页 这些方法往往只适用于某些特殊样品或不常见有这些方法往往只适用于某些特殊样品或不常见有机酸的分析，而且能机酸的分析，而且能达到同时分离的有机酸种类达到同时分离的有机酸种类较少较少。 离子色谱法多采用稀强酸离子色谱法多采用稀强酸, ,如稀盐酸和稀硫酸作淋如稀盐酸和稀硫酸作淋洗液洗液, ,对设备有一定腐蚀作用对设备有一定腐蚀作用。而高效液相色谱法。而高效液相色谱法分析有机酸可以克服上述不足之处分析有机酸可以克服上述不足之处, , 并

15、且实现一并且实现一机多用机多用, ,一柱多用一柱多用。第15页/共68页 在高效液相色谱法检测食品中的有机酸时，在高效液相色谱法检测食品中的有机酸时，最重最重要的是选择最佳的色谱分离条件要的是选择最佳的色谱分离条件，这些条件中涉，这些条件中涉及流动相的及流动相的pHpH值、流速、柱温、检测波长等等。值、流速、柱温、检测波长等等。 流动相配比影响着流动相的流动相配比影响着流动相的pHpH值值，从而对柱效和，从而对柱效和峰的分离均有影响。峰的分离均有影响。第16页/共68页 流速流速同样是影响其分离效果的一个重要因素，流速同样是影响其分离效果的一个重要因素，流速过低则分离时间过长，柱效差，而流速过

16、高又导致过低则分离时间过长，柱效差，而流速过高又导致峰挤在一起分不开。峰挤在一起分不开。 根据色谱理论，根据色谱理论，柱温柱温是影响柱效和分离度的主要因是影响柱效和分离度的主要因素，柱温升高可以降低流动相的粘度和提高树脂的素，柱温升高可以降低流动相的粘度和提高树脂的传质效率，但是太高又会破坏色谱柱，所以色谱条传质效率，但是太高又会破坏色谱柱，所以色谱条件的选择是相当复杂的，要综合众多的考虑因素。件的选择是相当复杂的，要综合众多的考虑因素。第17页/共68页l 总酸度的测定总酸度的测定 果品中的果品中的总酸度是指未离解和已离解的酸的总浓度总酸度是指未离解和已离解的酸的总浓度，总酸度的含量随果品的

17、生育期和贮藏的阶段不同，总酸度的含量随果品的生育期和贮藏的阶段不同，有着很大的变化，直接影响着果品的味道，颜色，有着很大的变化，直接影响着果品的味道，颜色，稳定性和质量的好环，是鉴定水果品质的一项最要稳定性和质量的好环，是鉴定水果品质的一项最要指标、由于在维持人体的酸碱平衡方面起着显著的指标、由于在维持人体的酸碱平衡方面起着显著的作用，所以，它亦直接影响着果品的营养价值，因作用，所以，它亦直接影响着果品的营养价值，因此，果品中的总酸度是食品检测分析中常做的项目此，果品中的总酸度是食品检测分析中常做的项目之一之一。第18页/共68页 方法原理：方法原理：样品中的有机酸用碱滴定时，被中和生成盐样品

18、中的有机酸用碱滴定时，被中和生成盐类。反应如下：类。反应如下： 注释注释 1 1本试验所用蒸馏水应经煮沸除去二氧化碳。本试验所用蒸馏水应经煮沸除去二氧化碳。 2 2若颜色过深，可先加入等量蒸馏水稀释后再滴若颜色过深，可先加入等量蒸馏水稀释后再滴 定或用定或用活性炭脱色（损失较大，滴定值偏低）。终点不易辨认时，活性炭脱色（损失较大，滴定值偏低）。终点不易辨认时，可用原样作对照，判明终点，也可改用电位或电导滴定法。可用原样作对照，判明终点，也可改用电位或电导滴定法。第19页/共68页3.3.总酸测定的结果一般以样品中含量最多的酸来总酸测定的结果一般以样品中含量最多的酸来表示。一般葡萄的总酸度用酒石

19、酸表示；柑桔以表示。一般葡萄的总酸度用酒石酸表示；柑桔以柠檬酸表示；苹果、核仁、核果、浆果和蔬菜类柠檬酸表示；苹果、核仁、核果、浆果和蔬菜类按苹果酸表示；牛乳、水产品以乳酸表示。按苹果酸表示；牛乳、水产品以乳酸表示。4.4.农产品中的有机酸均为弱酸，用强碱农产品中的有机酸均为弱酸，用强碱(NaOH)(NaOH)滴滴定时，其滴定终点偏碱，一般在定时，其滴定终点偏碱，一般在pH8.2pH8.2左右，所左右，所以，可选用酚酞作为指示剂，微红色，以，可选用酚酞作为指示剂，微红色，30s30s内不内不褪色为终点。褪色为终点。 。第20页/共68页5.5.氢氧化钠标准溶液用基准物质来标定。常用的氢氧化钠标

20、准溶液用基准物质来标定。常用的有有草酸草酸和和邻苯二甲酸氢钾邻苯二甲酸氢钾等。采用邻苯二甲酸等。采用邻苯二甲酸氢钾，它与氢氧化钠的反应为：氢钾，它与氢氧化钠的反应为： KHCKHC8 8H H4 4O O4 4 + NaOH KNaHC + NaOH KNaHC8 8H H4 4O O4 4 + H + H2 2O O 到达化学计量点时，溶液呈弱碱性，可用到达化学计量点时，溶液呈弱碱性，可用酚酞酚酞作指示剂。作指示剂。第21页/共68页 标定盐酸常用的基准物质有标定盐酸常用的基准物质有无水碳酸钠无水碳酸钠 NaNa2 2COCO3 3和和硼砂硼砂NaNa2 2B B4 4O O7 710H10

21、H2 2O O。采用硼砂较易提纯，不易吸采用硼砂较易提纯，不易吸湿，性质比较稳定，而且摩尔质量很大，可以减湿，性质比较稳定，而且摩尔质量很大，可以减少称量误差。硼砂与盐酸的反应为：少称量误差。硼砂与盐酸的反应为： NaNa2 2B B4 4O O7 710H10H2 2O + 2HCL 2NaCL + 4HO + 2HCL 2NaCL + 4H3 3BOBO3 3 + + 5H5H2 2O O 在化学计量点时，由于生成的硼酸是弱酸，在化学计量点时，由于生成的硼酸是弱酸，溶液的溶液的pHpH值约为值约为5 5，可用甲基红（，可用甲基红（4.44.46.2, 6.2, 红黄红黄 ）作指示剂。）作指

22、示剂。 第22页/共68页l 挥发性酸的测定挥发性酸的测定 挥发性酸主要是指醋酸、蚁酸、丁酸和痕量的甲酸挥发性酸主要是指醋酸、蚁酸、丁酸和痕量的甲酸等等霉烂的果蔬、籽粒，未成熟的种子和果实，常含霉烂的果蔬、籽粒，未成熟的种子和果实，常含有较多的挥发性酸，它的含量是农产品品质好坏的有较多的挥发性酸，它的含量是农产品品质好坏的一个重要指标。一个重要指标。第23页/共68页 挥发性酸包括游离态和结合态两部分。前者在蒸挥发性酸包括游离态和结合态两部分。前者在蒸馏时较易挥发，后者比较困难。测定挥发性酸的馏时较易挥发，后者比较困难。测定挥发性酸的方法有直接法和间接法。直接法是用碱液滴定由方法有直接法和间接

23、法。直接法是用碱液滴定由蒸馏或其它方法所得的挥发性酸；间接法是将挥蒸馏或其它方法所得的挥发性酸；间接法是将挥发性酸蒸发除去后，滴定残渣的不挥发酸的酸度，发性酸蒸发除去后，滴定残渣的不挥发酸的酸度，再由总酸度减去此残渣酸度即得挥发酸含量。一再由总酸度减去此残渣酸度即得挥发酸含量。一般用直接法较为方便般用直接法较为方便。 第24页/共68页方法原理方法原理 挥发酸可用水蒸气分离，加入磷酸可以使结合挥发酸可用水蒸气分离，加入磷酸可以使结合挥发性酸离析。挥发性酸经冷凝收集后，再挥发性酸离析。挥发性酸经冷凝收集后，再用标准碱滴定。用标准碱滴定。第25页/共68页注意事项注意事项：1.1.蒸馏前蒸汽发生瓶

24、中的水应先煮沸蒸馏前蒸汽发生瓶中的水应先煮沸l0minl0min，以排除，以排除其其中的中的COCO2 2，并用蒸汽冲洗整个蒸馏装置。，并用蒸汽冲洗整个蒸馏装置。 2.2.整套蒸馏装置的各个连接处应密封，整套蒸馏装置的各个连接处应密封，切不可漏气切不可漏气。3.3.滴定前将馏出液加热至滴定前将馏出液加热至60606565，使其终点明显，使其终点明显，加加快反应速度，缩短滴定时间，减少溶液与空气的接快反应速度，缩短滴定时间，减少溶液与空气的接触触，提高测定精度。，提高测定精度。第26页/共68页4 4磷酸的浓度：磷酸的浓度：1 19 9，50ml50ml加加1ml1ml。5 5挥发性酸的滴定须把

25、蒸出液为挥发性酸的滴定须把蒸出液为300ml300ml左右。左右。6 6滴定终点，滴定终点，1min1min不褪色为终点。不褪色为终点。7.7.挥发性酸的结果计算以蚁酸计挥发性酸的结果计算以蚁酸计。蚁酸的摩尔质。蚁酸的摩尔质量为量为60g60g。第27页/共68页l 有效酸度有效酸度(pH)(pH)的测的测定定 果蔬食品的果蔬食品的pHpH值的变动不仅取决于原料品种和成值的变动不仅取决于原料品种和成熟度，而且取决于加工方法。熟度，而且取决于加工方法。 其其pHpH值与总酸度之间没有严格的比例关系，值与总酸度之间没有严格的比例关系，pHpH值值的大小不仅取决于酸的数量和性质的大小不仅取决于酸的数

26、量和性质( (种类种类) )，而且，而且受其中的酸、果胶、某些盐类和蛋白质缓冲能力受其中的酸、果胶、某些盐类和蛋白质缓冲能力的影响。的影响。第28页/共68页 提取：提取：一般的果蔬样品，与水一般的果蔬样品，与水1 11 1研磨，过滤；研磨，过滤；干果、籽粒，水干果、籽粒，水2-32-3倍，沸水煮倍，沸水煮30min30min，过滤测定。，过滤测定。 测定测定pHpH值测定的方法应用最广泛的有：值测定的方法应用最广泛的有：pHpH试纸法试纸法、标标准色管比色法准色管比色法和和pHpH计测定法计测定法。其中以。其中以pHpH计法最准计法最准确，操作也简便、迅速，可排除或减小这些样品确，操作也简便

27、、迅速，可排除或减小这些样品中所含的色泽和杂质对测定结果所造成的影响中所含的色泽和杂质对测定结果所造成的影响, ,测测得较准确的数据得较准确的数据。第29页/共68页 pHpH计的型号很多，使用时参照说明书即可。计的型号很多，使用时参照说明书即可。pHpH标准溶液可以用国家计量管理机关提供的标准溶液可以用国家计量管理机关提供的标准物质按规定配制；或按一般专业书籍上标准物质按规定配制；或按一般专业书籍上的配方配制。的配方配制。第30页/共68页l 水果、蔬菜等有机酸组分的测定水果、蔬菜等有机酸组分的测定 ( ( 高效液相色谱法高效液相色谱法 ) ) 有机酸是果、蔬的主要组成分之一。果、蔬中有有机

28、酸是果、蔬的主要组成分之一。果、蔬中有机酸的种类和含量变化很大。这些变化决定于机酸的种类和含量变化很大。这些变化决定于品品种、成熟度、气候条件及其它因素种、成熟度、气候条件及其它因素。果蔬中苹果。果蔬中苹果酸和柠檬酸的一般含量范围见表酸和柠檬酸的一般含量范围见表17-117-1。第31页/共68页第32页/共68页方法原理方法原理v样品经处理后，直接将样品液注入反相化学键样品经处理后，直接将样品液注入反相化学键合相色谱体系，用合相色谱体系，用5g5gL L-1-1(NH(NH4 4) )2 2HPOHPO4 4 为流动相，为流动相，有机酸在两相中分配分离；有机酸在两相中分配分离；v按照其碳原子

29、数由少到多的顺序从色谱柱中洗按照其碳原子数由少到多的顺序从色谱柱中洗脱下来；脱下来；v用紫外检测器用紫外检测器(214nm)(214nm)或示差折光检测器或或示差折光检测器或二二极管阵列检测器极管阵列检测器检测并与标准样品比较定量。检测并与标准样品比较定量。第33页/共68页l 操作步骤操作步骤 有机酸标准溶液的制备有机酸标准溶液的制备 分别取适量有机酸单个标准样，如酒石酸、苹果酸、柠檬分别取适量有机酸单个标准样，如酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等于酸、琥珀酸等于25mL25mL容量瓶中，用容量瓶中，用0.01mo1/LNaOH0.01mo1/LNaOH溶液溶解后定容，参照表溶液溶解后定容，参

30、照表17-117-1的的含量范围配制标准浓度系列。含量范围配制标准浓度系列。第34页/共68页l 样品溶液的制备样品溶液的制备 液体样品液体样品：需经合适倍数稀释，需经合适倍数稀释，用用Sep-PAK CSep-PAK C1818净化净化柱处理柱处理（有色素等杂质（有色素等杂质, ,会干扰有机酸的分析会干扰有机酸的分析, ,同时造成色谱柱的污染，因此同时造成色谱柱的污染，因此, ,在样品前处理中在样品前处理中必须将其去除），收集馏出液，经必须将其去除），收集馏出液，经0.450.45m m微孔微孔滤膜过滤滤膜过滤后备用。后备用。第35页/共68页 固体或半固体样品固体或半固体样品：要将其捣碎，

31、均质后，加：要将其捣碎，均质后，加入入一定量的一定量的0.01mo1/LNaOH0.01mo1/LNaOH（或（或8080乙醇）溶乙醇）溶液提取液提取。经离心分离或过滤后收集提取液，用。经离心分离或过滤后收集提取液，用Sep-PAK CSep-PAK C1818（Waters Sep-Pak CWaters Sep-Pak C1818小柱固相小柱固相萃取）萃取）净化柱处理净化柱处理，收集馏出液。经，收集馏出液。经0.450.45 m m微微孔滤膜过滤孔滤膜过滤后备用。后备用。第36页/共68页 该技术所用设备简单，价格低廉，溶剂用量较少，该技术所用设备简单，价格低廉，溶剂用量较少，能够高效率、

32、有选择地分离和富集极性不同的样能够高效率、有选择地分离和富集极性不同的样品，品，是一种可靠性高和实用的现代分离技术。是一种可靠性高和实用的现代分离技术。SPE SPE 改善、简化了分离，改善、简化了分离，提高了色谱柱寿命，降提高了色谱柱寿命，降低了检测限低了检测限第37页/共68页l 色谱条件色谱条件 固定相：固定相：C C1818键合相键合相 流动相：流动相：5g5gL L-1-1(NH(NH4 4) )2 2HPOHPO4 4，pH=2.5pH=2.5 流流 速：速：2mL2mLminmin-1-1 进样量：进样量：1010L L 检测器：检测器：紫外检测器，紫外检测器，214nm214n

33、m，0.1AUFS0.1AUFS第38页/共68页 最常用的最常用的“万能柱万能柱”填料为填料为“C C1818”，简称，简称“ODSODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（OctadecylsilylOctadecylsilyl，简称，简称ODSODS）。这种填料在反相）。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用。由于色谱中发挥着极为重要的作用。由于C C1818(ODS)(ODS)是长是长链烷基键合相链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此

34、在生物化学分析工作中应用的最为广泛，近年来，在生物化学分析工作中应用的最为广泛，近年来，为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了展了CHCH、C C3 3、C C4 4等短链烷基键合相和大孔硅胶等短链烷基键合相和大孔硅胶（202040m40m）。）。第39页/共68页 按键合到基质上的官能团可分为：按键合到基质上的官能团可分为： 反相柱：反相柱：填料是非极性的，官能团为烷烃，例如：填料是非极性的，官能团为烷烃，例如：C C1818(ODS)(ODS)、C C8 8、C C4 4等。等。 正相柱：正相柱：填料是极性的，官能团为填料是极性的，官能

35、团为 CNCN氰基、氰基、NHNH2 2氨基等。氨基等。第40页/共68页l 测定和计算测定和计算将待测样将待测样1010 L L注入色谱仪，根据其峰高或峰面积注入色谱仪，根据其峰高或峰面积设定有关最佳参数如最小峰面积。设定有关最佳参数如最小峰面积。注入有机酸标准系列溶液注入有机酸标准系列溶液1010 L L，进行色谱分析。，进行色谱分析。以各标准溶液的保留时间定性以各标准溶液的保留时间定性。 定性：将各种单一有机酸液依次进样，记录各自定性：将各种单一有机酸液依次进样，记录各自保留时间。保留时间。第41页/共68页方法方法 a.a.在相同的色谱条件下在相同的色谱条件下, ,将样品色谱图与有机酸

36、标准将样品色谱图与有机酸标准液色谱图进行对照液色谱图进行对照, ,根据保留时间确定样品中的有机根据保留时间确定样品中的有机酸酸; ; b.b.在样品中加入有机酸的标准液在样品中加入有机酸的标准液, ,根据峰高的突增来根据峰高的突增来进一步验证色谱峰的归属进一步验证色谱峰的归属; ; c c比较各有机酸在标准液和样液色谱图中的紫外吸比较各有机酸在标准液和样液色谱图中的紫外吸收图谱。收图谱。第42页/共68页 有机酸的定量：有机酸的定量： 外标法，外标法，将不同浓度酸液从低浓度到高浓度依次进样，将不同浓度酸液从低浓度到高浓度依次进样， 计算各自的峰面积，每个样平行进计算各自的峰面积，每个样平行进5

37、 5次，次，作各种有机作各种有机酸的峰面积或峰高与浓度的标准曲线酸的峰面积或峰高与浓度的标准曲线。根据有机酸。根据有机酸标准系列溶液各响应值标准系列溶液各响应值( (峰高或峰面积峰高或峰面积) )作一响应值作一响应值与浓度的标准曲线。与浓度的标准曲线。 分别注入待测样品分别注入待测样品1010L L，进行色谱分析。，进行色谱分析。 根据各待测样品的响应值，在标准曲线上查出其相根据各待测样品的响应值，在标准曲线上查出其相应的含量。应的含量。第43页/共68页第44页/共68页标准曲线制作标准曲线制作 第45页/共68页第46页/共68页第47页/共68页第48页/共68页 说明说明 在样品溶液测

38、定中，每进在样品溶液测定中，每进3 3次样液，就应进次样液，就应进1 1次标次标准溶液进行校正，并重新计算校正系数，以保证准溶液进行校正，并重新计算校正系数，以保证测定结果的准确度。测定结果的准确度。 样品液制备须经样品液制备须经0.450.45m m滤膜过滤后才能上机测定滤膜过滤后才能上机测定，否则引起柱的污染和测定干扰。否则引起柱的污染和测定干扰。 流动相（载液）：流动相（载液）：5g5gL L-1-1(NH(NH4 4) )2 2HPOHPO4 4，须准确，须准确pH=2.5pH=2.5，并经滤膜过滤后、脱气后才能使用。否，并经滤膜过滤后、脱气后才能使用。否则分离不好，引起较大误差则分离

39、不好，引起较大误差。第49页/共68页 标准液的浓度与样品中相应有机酸的浓度相一致，标准液的浓度与样品中相应有机酸的浓度相一致，才能有较大的准确性。才能有较大的准确性。可查阅相关手册，了解样品可查阅相关手册，了解样品酸的含量范围。酸的含量范围。 用用反相色谱法测定水果及果汁中的有机酸反相色谱法测定水果及果汁中的有机酸 。 固定相的极性大于流动相时，叫正相。固定相的极性大于流动相时，叫正相。即固定相为即固定相为极性，流动相为非极性。常用于分离极性较强的化极性，流动相为非极性。常用于分离极性较强的化合物，分析的顺序是极性较低的组分保留值小，先合物，分析的顺序是极性较低的组分保留值小，先流出色谱柱。

40、流出色谱柱。第50页/共68页 流动相的极性应小于固定相的极性，流动相的极性应小于固定相的极性，常用常用饱和烃饱和烃作流动相的洗脱剂，加入适量的极性溶剂（甲醇、作流动相的洗脱剂，加入适量的极性溶剂（甲醇、异丙醇等）异丙醇等）作调节剂以调节流动相的极性。作调节剂以调节流动相的极性。 反相分配色谱法，与正相的相反，反相分配色谱法，与正相的相反，常用于分离极常用于分离极性较弱的化合物，分析的顺序是性较弱的化合物，分析的顺序是极性较强的组分极性较强的组分保留时间短，先流出色谱柱。保留时间短，先流出色谱柱。 反相色谱中多反相色谱中多以水（极性最强）和有机溶剂的混以水（极性最强）和有机溶剂的混合物作流动相

41、，合物作流动相，常用的流动相是甲醇常用的流动相是甲醇/ /水、乙腈水、乙腈/ /水。水。第51页/共68页 分离有机酸分离有机酸, ,既要考虑流动相的组成，浓度及既要考虑流动相的组成，浓度及pHpH，还要考虑有机酸的强弱，还要考虑有机酸的强弱，磷酸盐缓冲液是磷酸盐缓冲液是C C1818反相反相柱上应用较广的流动相。实验证明：选择磷酸二柱上应用较广的流动相。实验证明：选择磷酸二氢铵，磷酸氢二铵，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾溶氢铵，磷酸氢二铵，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾溶液作流动相，结果表明液作流动相，结果表明, ,这四种缓冲液为流动相，这四种缓冲液为流动相，分离效果相同，当浓度相同分离效果相同，当浓度相同

42、, ,采用磷酸二氢铵为流采用磷酸二氢铵为流动相时动相时, ,各有机酸的响应值最大各有机酸的响应值最大, ,选用磷酸二氢铵选用磷酸二氢铵为流动相为流动相。第52页/共68页 有机酸组分的测定有机酸组分的测定( (气相色谱法气相色谱法) ) 采用气相色谱法采用气相色谱法 由于有机酸的强极性及部分由于有机酸的强极性及部分有机酸对热的不稳定性和吸附性有机酸对热的不稳定性和吸附性, ,故常将其酯化故常将其酯化制备成甲酯、苄酯等衍生物进行分析制备成甲酯、苄酯等衍生物进行分析, ,但这样往但这样往往会造成分析结果失真往会造成分析结果失真, ,且手续繁杂。且手续繁杂。第53页/共68页 方法原理方法原理：在硫

43、酸的催化下，使有机酸成为丁酯的衍生物，在硫酸的催化下，使有机酸成为丁酯的衍生物，用气相色谱法分别定量。用气相色谱法分别定量。可定量的有机酸有：甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、可定量的有机酸有：甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、乳酸、异戊酸、异乙酸、正己酸、乙酰正丁酸、乳酸、异戊酸、异乙酸、正己酸、乙酰丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、反丁烯二酸、苹丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、反丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、反丙烯三羧酸以及柠檬酸等。果酸、酒石酸、反丙烯三羧酸以及柠檬酸等。第54页/共68页 操作步骤操作步骤试样准备试样准备 蔬菜蔬菜：把样品切成把样品切成3mm3mm见方，称取见方，称取25.0g25.0g加加

44、温水温水(80(80，部分蔬菜可用部分蔬菜可用800ml/L800ml/L乙醇代替研磨乙醇代替研磨) )，提取，提取2 2次，合次，合并提取液，加并提取液，加酚酞指示剂酚酞指示剂，用，用0.1mol/LNaOH0.1mol/LNaOH溶液滴溶液滴定，定，求总酸量求总酸量，同时使有机酸成为钠盐。中和后的溶，同时使有机酸成为钠盐。中和后的溶液，在液，在4040下用下用旋转蒸发器浓缩旋转蒸发器浓缩至约至约15mL15mL，浓缩液移，浓缩液移入入25mL25mL容量瓶并容量瓶并定容定容。必要时可过滤除去不溶物。必要时可过滤除去不溶物。第55页/共68页第56页/共68页 水果：水果：从新鲜水果样品中称

45、取从新鲜水果样品中称取2.0g2.0g，加，加3 3倍量的倍量的800ml/L800ml/L乙醇乙醇研磨研磨，以离心分离后，收集上清液，以离心分离后，收集上清液，残渣再反复提取残渣再反复提取2 2次，合并提取液，加次，合并提取液，加酚酞指示酚酞指示剂剂，用，用0.1mol/LNaOH0.1mol/LNaOH溶液中和。中和后在溶液中和。中和后在8080恒温水槽中加热恒温水槽中加热10min10min后，后，定容定容至至200mL200mL，使用前，使用前保存于冰箱中。保存于冰箱中。第57页/共68页 取此提取液取此提取液101050mL50mL，用，用旋转蒸发器浓缩至无醇旋转蒸发器浓缩至无醇后后

46、，依次，依次通过通过Amberite CGl20Amberite CGl20、CG4BCG4B及及CGl20CGl20柱，柱，得到有机酸组分得到有机酸组分，加入，加入酚酞指示剂酚酞指示剂并滴定，并滴定，求出求出总酸含量总酸含量。然后保存于约。然后保存于约4040下，用下，用旋转蒸发器旋转蒸发器浓缩浓缩，干涸后进行，干涸后进行丁酯化丁酯化处理。处理。第58页/共68页 酯化酯化 用上述方法制备的有机酸中，加用上述方法制备的有机酸中，加丁醇丁醇2mL2mL，无水硫酸钠无水硫酸钠2g2g，浓硫酸，浓硫酸0.2ml0.2ml，连接冷凝管，在，连接冷凝管，在电热板上平稳沸腾约电热板上平稳沸腾约30min(30min(加热时要不断搅拌加热时要不断搅拌) )，使有机酸成为