核医学其它体外分析分子核进展PPT课件

1、 举例：举例：TBGTBG甲状腺素结合球蛋白甲状腺素结合球蛋白甲状腺素甲状腺素 CBGCBG皮质醇结合球皮质醇结合球propro皮质醇皮质醇 SHBGSHBG性激素结合球性激素结合球propro皮质醇皮质醇 内因子结合蛋白内因子结合蛋白B12B12 视蛋白视蛋白视黄醛视黄醛 蛋白激酶蛋白激酶CAMPCAMP、cGMPcGMP 牛乳蛋白酶、叶酸还原酶牛乳蛋白酶、叶酸还原酶叶酸叶酸 第1页/共27页 方法：竞争性与方法：竞争性与RIA相同相同 优点：这些蛋白天然存在，来源丰富，制备简单，省时，方法学成熟易建优点：这些蛋白天然存在，来源丰富，制备简单，省时，方法学成熟易建立。立。 缺点：缺点： 比抗

2、体的特异性差、灵敏度也差，为了提高特异性，须在样品制备比抗体的特异性差、灵敏度也差，为了提高特异性，须在样品制备上下功夫。如纯化，清除干扰物等，不够方便。上下功夫。如纯化，清除干扰物等，不够方便。 该类蛋白种类有限，应用范围受限，已有很多被该类蛋白种类有限，应用范围受限，已有很多被RIA和和IRMA取代。取代。 第2页/共27页 二、放射受体分析二、放射受体分析RRA RRA与与RBA的区别的区别 含义：以受体为结合剂，利用竞争结合原理对配体进行体外分析。含义：以受体为结合剂，利用竞争结合原理对配体进行体外分析。 受体的分类：受体的分类： 膜膜R：一般为水溶性配体（肽类激素、儿：一般为水溶性配

3、体（肽类激素、儿茶酚胺等）茶酚胺等） 胞内胞内R：（浆：（浆or核），一般为脂溶性的核），一般为脂溶性的配体（甲状腺素，类固醇）配体（甲状腺素，类固醇） 受体样品的制备：与受体样品的制备：与RBA相同。相同。 第3页/共27页标记品的要求：标记品的要求： 要求配体标记前后生物活性不受影响。因为要求配体标记前后生物活性不受影响。因为标记配体在标记配体在RRA时活性往往是降低的。如时活性往往是降低的。如125I标上一标上一个不影响，如果有二个个不影响，如果有二个125I标上就有变化了。标上就有变化了。RRA的优点：的优点： 1、R与与L的结合反应快、瞬间完成、比的结合反应快、瞬间完成、比RIA出结

4、果快。出结果快。 2、能反应、能反应L的生物学活性。如冬眠灵有多的生物学活性。如冬眠灵有多种衍生物，它们均能与特异抗体结合，但只有有生物种衍生物，它们均能与特异抗体结合，但只有有生物活性的衍生物才能与受体结合，这种测定反应活性的衍生物才能与受体结合，这种测定反应L的生的生物学活性，而不是免疫活性。所以研究物质结合与功物学活性，而不是免疫活性。所以研究物质结合与功能能RRA占有相当的地位。占有相当的地位。第4页/共27页RRA的缺点：的缺点： 1、灵敏度比、灵敏度比RIA小小10100倍，这是因为不同组织间得来的受体对倍，这是因为不同组织间得来的受体对配体的亲和力有差异，又难以寻找高亲和力的受体

5、。配体的亲和力有差异，又难以寻找高亲和力的受体。 2、反应条件和环境严格，离子强度，温度、反应条件和环境严格，离子强度，温度、PH值要求高。值要求高。 3、NSB结合容量大，亲和力又小，结合容量大，亲和力又小，NSB较大较大第5页/共27页临床应用：临床应用： 1、利用受体来测体内配体的含量。、利用受体来测体内配体的含量。 2、测定体内抗受体抗体的量。、测定体内抗受体抗体的量。 有些疾病发现体内存在着抗有些疾病发现体内存在着抗R的抗体（自身的抗体（自身抗体），如抗体），如Gtraves disease(TSH、甲状腺素、甲状腺素R的抗体的抗体)；Insulin B型抗症（型抗症（Ins R-A

6、b）、重症肌）、重症肌无力（乙酰胆硷受体抗体）无力（乙酰胆硷受体抗体）。这类受体的抗体有两类特征：这类受体的抗体有两类特征： 1、受体结合部位抗体（、受体结合部位抗体（RAb）：当）：当R与与Ab成复合物时，复合物中的成复合物时，复合物中的R可再与配体结合，即可再与配体结合，即R的的结合位点保留，但复合物却抑制配体与单独存在的游结合位点保留，但复合物却抑制配体与单独存在的游离离R相结合。相结合。 2、受体非结合部位抗体（、受体非结合部位抗体（Ab）：它的特征）：它的特征是复合物对配体与是复合物对配体与R的结合无抑制作用。的结合无抑制作用。 第6页/共27页 1、酶的活性（力）分析、酶的活性（力

7、）分析 概念：酶活性（力）：指酶催化加速反应的能概念：酶活性（力）：指酶催化加速反应的能力。力。 表示法：浓度表示法：浓度/时间（反应酶促反应速度的快时间（反应酶促反应速度的快慢）慢） 酶的反应速度，可以是底物的消耗量或产物的酶的反应速度，可以是底物的消耗量或产物的生成量生成量 单位：单位：Kat：（催量）指在规定条件下，每秒：（催量）指在规定条件下，每秒钟酶催化钟酶催化1mol底物转变所需要酶的量。底物转变所需要酶的量。 旧单位：旧单位：U；1 U=16.67kat 符号：底物用符号：底物用S表示，表示， S*指标记的底物指标记的底物 酶用酶用E表示表示 P产物产物 反应式：反应式：*S+E

8、 E*S E*P *P+E 经过一般时间，从反应液中分离出经过一般时间，从反应液中分离出*P，测放。，测放。第7页/共27页 * P 的CPS 酶活性（力）的计算（kat）=- SAte *P的CPS 酶的比活力（kat/g）=- SAtew 可知以下几个量：t（分）：*P的放射性CPS；SA标记物的比活度；e仪器效率；W参加反应的酶的蛋白量（mg）。 第8页/共27页优点优点:1、灵敏度高（放射性标记品）、灵敏度高（放射性标记品）2、特性性强，由酶的专一性决定。、特性性强，由酶的专一性决定。3、适用广，绝大多数酶可用此法。、适用广，绝大多数酶可用此法。缺点缺点:1、需高质量的定位标记物、需高

9、质量的定位标记物2、分离方法复杂，难以自动化。、分离方法复杂，难以自动化。酶液制备酶液制备：标记物制备与选择标记物制备与选择PH、激活或抑制剂的使用、温度、时间等（自学）、激活或抑制剂的使用、温度、时间等（自学）第9页/共27页 2、酶促同位素衍生物分析酶促同位素衍生物分析：实际上分析底物含量。：实际上分析底物含量。反应：标记试剂反应：标记试剂+待测底物待测底物 标记衍生物标记衍生物 E举例：举例：32PrATP+胆硷胆硷 32P一磷酰胆硷一磷酰胆硷+ADP激酶激酶胆硷胆硷 衍生物的放射性强弱衍生物的放射性强弱标记试剂比活度标记试剂比活度可计算待测物量可计算待测物量 （底物）（底物）注意：需要

10、知道一个分子待测物能与标记试剂结合的分子比。如果用双同位素标注意：需要知道一个分子待测物能与标记试剂结合的分子比。如果用双同位素标记可以更准确。记可以更准确。 第10页/共27页3、酶的激动剂和抑制剂测定法：、酶的激动剂和抑制剂测定法： 原理：激动或抑制剂可加快或减慢酶促反原理：激动或抑制剂可加快或减慢酶促反应的速率，用系列浓度的激动或抑制剂与酶进应的速率，用系列浓度的激动或抑制剂与酶进行定时反应，分离产物测放射性，可计算出激行定时反应，分离产物测放射性，可计算出激动剂或抑制剂的量。动剂或抑制剂的量。如磷酸吡哆醛能使如磷酸吡哆醛能使酪氨酸脱羧基产生酪氨酸脱羧基产生Co2，14C标记酪氨酸经标记

11、酪氨酸经磷酸吡哆醛作用产生磷酸吡哆醛作用产生14Co2，可计算可计算磷酸吡哆醛的量。磷酸吡哆醛的量。第11页/共27页与酶的底物分析相与酶的底物分析相同同 该法类同该法类同RIARIA的竞争，不同之处是的竞争，不同之处是E E不断从不断从E E* *S S和和ESES中释放出来而再去与中释放出来而再去与S S反应，如果反应时间足够反应，如果反应时间足够长，因长，因* *S S与与S S为同一物，会均被转化为产物，失去为同一物，会均被转化为产物，失去竞争之间的函数关系，所以不能象竞争之间的函数关系，所以不能象RIARIA那样等待反那样等待反应平衡，而应该在一定时间就得分离测定。应平衡，而应该在一

12、定时间就得分离测定。这是它的关键（特点之一）这是它的关键（特点之一） 5， ELISAELISA：固相酶标记：固相酶标记- -免疫分析免疫分析 待测抗原固相化，然后与酶标记的抗体结合形成复合物，最后不测放射性而是让酶显待测抗原固相化，然后与酶标记的抗体结合形成复合物，最后不测放射性而是让酶显色计算物质含量。色计算物质含量。第12页/共27页6、整体酶活力测定及应用、整体酶活力测定及应用二氧化碳呼气试验：二氧化碳呼气试验：用用14C或或13C等标记酶的底物，如经等标记酶的底物，如经过酶的作用，其产物中可收集到过酶的作用，其产物中可收集到CO2等，反映酶活力。等，反映酶活力。应用：幽门螺杆菌可产生

13、尿素酶。应用：幽门螺杆菌可产生尿素酶。如果胃内有幽门螺杆菌，可将如果胃内有幽门螺杆菌，可将14C标记的尿素分解为标记的尿素分解为14CO2。因此有。因此有了呼气了呼气14CO2。检测幽菌的检验。检测幽菌的检验。第13页/共27页7、其它体外分析的新进展、其它体外分析的新进展 化学发光分析（化学发光分析（CLIA）：）：如发光剂鲁米诺经氧化剂如发光剂鲁米诺经氧化剂H2O2和催化剂（和催化剂（HRP）作用下放出光子（发光）作用下放出光子（发光）特点：特点：a、用发光物质代替放素建立的免疫分析。、用发光物质代替放素建立的免疫分析。b、试剂盒稳定性更好，发光物用特殊处理后才发光。、试剂盒稳定性更好，发

14、光物用特殊处理后才发光。c、无放射性污染、无放射性污染d、设备相对简单（仍昂贵，但、设备相对简单（仍昂贵，但RIA也贵）也贵）e、发光效率与温度有关，须配备恒温设备、发光效率与温度有关，须配备恒温设备f、 临床上可应用项目有限，价格高于临床上可应用项目有限，价格高于RIA第14页/共27页时间分辨荧光免疫分析（时间分辨荧光免疫分析（TrFIA） 概念：稀土元素：稀土元素不是土概念：稀土元素：稀土元素不是土,是周期表中是周期表中5771号元素的总称，现号元素的总称，现又新发现二个钪、钇，共计又新发现二个钪、钇，共计17个元素。个元素。 如果用稀土元素标记化合物，而这些稀土元素如如果用稀土元素标记

15、化合物，而这些稀土元素如Eu（铕）、（铕）、Tb（铽）（铽）Te、Sm（钐）、（钐）、Dy（镝）等可发射荧光，在紫外线激发下其发光能谱和发光时间相对集中而（镝）等可发射荧光，在紫外线激发下其发光能谱和发光时间相对集中而稳定。而干扰因素的本底发光寿命很短，可将标记物放置短时间，待本底光暴光后再去稳定。而干扰因素的本底发光寿命很短，可将标记物放置短时间，待本底光暴光后再去测量稀土荧光，所以叫时间分辨。必要时其发光还可做些增效处理。测量稀土荧光，所以叫时间分辨。必要时其发光还可做些增效处理。第15页/共27页该方法优点：该方法优点：1、灵敏度高，特异性强、灵敏度高，特异性强2、出结果快、出结果快3、

16、样品荧光能重现、样品荧光能重现4、无放射性污染、无放射性污染缺点：仪器价格贵缺点：仪器价格贵 配套试剂制备困难配套试剂制备困难第16页/共27页免疫免疫PCR原理：用原理：用DNA做标记物，用做标记物，用PCR法扩增产物上的法扩增产物上的DNA，通量测定，通量测定DNA的量进行定性研究。的量进行定性研究。基本反应：基本反应：1）将待测物抗原固化试管底部）将待测物抗原固化试管底部2）加入生物素标记的特异抗体）加入生物素标记的特异抗体Ab-b3）加入亲和素）加入亲和素A做为连接分子做为连接分子 Ag+Ab-b+AAgAb-b-A4）再加入生物素标记的）再加入生物素标记的DNA-b得得AgAb-b-

17、A-b-DNA 引物引物 PCR扩增扩增 染色染色 记录记录PCR扩增的扩增的DNA量确定量确定Ab的含量。的含量。第17页/共27页优点：优点：1） 特异性强（与特异性强（与RIA相同）相同）2）灵敏度高（比酶标高）灵敏度高（比酶标高1000倍，也高于倍，也高于RIA）3）操作简单）操作简单缺点：缺点：1）假阳性高）假阳性高2）影响实验准确度的因素多）影响实验准确度的因素多3）未商品化）未商品化第18页/共27页还有化学发光酶免疫分析（CLEIA）p209 用硷性磷酸酶标记Ab，反应的复合物带有酶，加入底物金刚烷（dioxetane phosphate）后酶促底物断裂而发光。电化学发光免疫分

18、析（ECL） p209 第19页/共27页8、活化分析： 基本原理，用粒子束（射线）照射样品，使其中待测稳定核素发生核反应变为放素，由于这些放素各具有一定的半衰期、固定的能量特征r射线或其它射线，测量其衰变出的射线能量和活度就可确定样品中各元素的种类和活度。临床应用：微量元素分析第20页/共27页活化分析的类型：活化分析的类型：1）中活化分析：）中活化分析：a、反应堆中子活化分析（广泛）、反应堆中子活化分析（广泛）b、中子高压倍加器（启动费用高）、中子高压倍加器（启动费用高）c、中子源，如、中子源，如Ra-Be中子源（中子源（Ra的的a粒子轰击粒子轰击Be可产生中子）可产生中子）d、自发裂变中

19、子源、自发裂变中子源252Cf（价格贵），将（价格贵），将239Pu在反应堆照射二年吸收在反应堆照射二年吸收13个中子才能得到个中子才能得到252Cf产额很低。产额很低。2）带电粒子活化分析：一般将带电子粒子如）带电粒子活化分析：一般将带电子粒子如P、d、a加速，然后轰击待测元素，产生新的加速，然后轰击待测元素，产生新的放素或稳定核素。如放素或稳定核素。如12C（p,r）13N3）r射线活化分析：较危险，目前很少用。射线活化分析：较危险，目前很少用。第21页/共27页活化分析的优点：活化分析的优点：灵敏度高灵敏度高10-9克左右克左右没有试剂污染没有试剂污染可进行非破坏性分析可进行非破坏性分析一次可同时分析几十种元素一次可同时分析几十种元素缺点：缺点：精确度低精确度低有干扰反应（副反应）有干扰反应（副反应）方法不易普及方法不易普及不能测化合物的量和结构。不能测化合物的量和结构。第22页/共27页最常用的计算公式（相对测量法）最常用的计算公式（相对测量法） WX AX - = - WS AS第23页/共27页8、质子激发、质子激发X线发射分析线发射分析PIXEA 原理：用高速运动的质子轰原理：用高速运动的质子轰击待测元素，待测元素原子核外电击待测元素，待测元素原子核外电子被击出，留下的空穴将被外层电子被击出，留下的