植化方法学沈阳药科大学天然药物化学教研室PPT课件

1、植化方法学涉及内容药材提取物单体化合物结构鉴定分离化学及波谱学提取第1页/共68页如何开展研究-注意点 查阅文献，了解研究现状1）、同种同属植物的相关文献2）、某类成分的相关文献 根据不同目的，确定实验方案1）、化学成分系统研究2）、某类化学成分的分离3）、某种已知化学成分的分离4）、活性成分的追踪分离 预试或小试1）、含有化学成分性质和类别2）、为放大试验而进行的小试第2页/共68页植化方法学（一）（各种色谱的分离原理及操作）一、硅胶相关色谱二、氧化铝相关色谱三、聚酰胺柱色谱四、葡聚糖凝胶柱色谱五、大孔吸附柱色谱六、离子交换柱色谱七、反应薄层色谱八、提取方法第3页/共68页一、硅胶相关色谱1

2、、硅胶的结构(SiO2.XH2O)OSiOSiOHOOOO第4页/共68页植化方法学（一）（各种色谱的分离原理及操作）一、硅胶相关色谱二、氧化铝相关色谱三、聚酰胺柱色谱四、葡聚糖凝胶柱色谱五、大孔吸附柱色谱六、离子交换柱色谱七、反应薄层色谱八、提取方法第5页/共68页2、分离原理吸附作用：氢键作用、偶极作用和静电作用等吸附强度的大小取决于硅醇基类型、硅醇基数目（比表面积）、孔体积、平均孔径3、使用范围 由于硅胶的弱酸性、往往适合于分离黄酮、香豆素、蒽醌、萜、甾体等中性或弱酸性类化合物。第6页/共68页第7页/共68页黄连生物碱的化学结构第8页/共68页薄层板： 硅胶G薄层板， 110 C 活化

3、1小时展开剂：乙酸乙酯-氯仿-甲醇-浓氨水-二乙胺（8:2:2:1:0.5）检测方式：UV366nm黄连生物碱硅胶薄层色谱图谱第9页/共68页4、常用硅胶的规格100140目、100200目（75150m）、200300目（4575 m ）为开放柱色谱用硅胶1040m为薄层色谱用硅胶210 m为高效薄层色谱或液相色谱用硅胶5、薄层色谱硅胶的种类硅胶G:含有石膏1214%，粒度1040m，pH67(10%)。硅胶H:不含石膏，pH67(10%)。硅胶GF254:含有石膏1214%，pH67(10%)，且含有少量的荧光剂。第10页/共68页6、硅胶含水量与活性之间的关系第11页/共68页细玻璃管法

4、测定硅胶活性 展开剂：苯第12页/共68页7、含水硅胶色谱 硅胶含水达17%以上为分配色谱，适宜分离生物碱、糖类、皂苷、有机酸等。表现在薄层和开放柱上，展开剂或洗脱剂为多相含水系统。薄层板：硅胶H展开剂： I: 正丁醇-乙酸乙酯-水 （4:1:1） II: 氯仿-甲醇-水 （65:35:10）下层显色：10%硫酸第13页/共68页第14页/共68页Oleanane-type and Protopanaxatriol-type Saponins from Panax ginseng第15页/共68页Panaxadiol-type Saponins from Panax ginseng第16页/共

5、68页8、硅胶制备薄层色谱操作方法1)、薄层的制备 2020cm2的玻璃板一般所用硅胶量为820g，5CMCNa的用量按1:22.5为宜，晾干，根据需要可进行活化。2)、点样（1050mg） 用玻璃毛细管或移液管将样品溶液线形点样于硅胶板上，点样线宽度要适宜，过窄易超载，过宽影响分离效果。3)、展开 晾干点样处溶剂后，以选好的展开剂进行展开，对有些化合物预饱和一段时间，分离效果更好。原点前沿第17页/共68页4)、标记色带 取出薄层板，晾干，根据荧光画出色带，或部分显色确定色带的位置。5)、剥离、提取 剥离色带部分的硅胶，以合适的溶剂直接提取或装入小玻璃柱进行洗脱。（忌用含水系统处理）6)、浓

6、缩 浓缩提取液或洗脱液得色带对应的化合物。多数情况下，需要进一步的精制或纯化处理。8、制备薄层色谱操作原点前沿第18页/共68页制备薄层色谱展开后处理第19页/共68页 9、硅胶柱色谱的操作（开放柱色谱）1)、拌样（干法上样）： 将分离样品溶于易挥散溶剂中，与三倍量的柱层析硅胶拌样。滴加样品溶液的同时应不断搅拌均匀，一旦达到制剂软材程度应停止滴加样品溶液，晾干或低温干燥（注意有毒溶剂的处理）后再继续操作，直到样品溶液全部加入。2)、装柱： 将拌样硅胶1020倍量的柱色谱硅胶浸泡于起始溶剂中，搅拌赶出气泡，装入准备好的玻璃柱中，平衡至不再下降为止。3)、上样： 待硅胶柱平衡好后，将干燥好的拌样硅

7、胶用漏斗加入柱子上部（加入前要保证起始溶剂在柱子中足够的高度以免带入气泡）。4)、加入保护硅胶或棉花：用起始溶剂洗脱至柱中上端溶剂颜色变浅或无色为止，然后加入适量硅胶或棉花起缓冲作用。第20页/共68页5)、柱色谱洗脱剂的选择 起始溶剂原则上对被分离样品中的任何物质都没有洗脱能力。洗脱溶剂的选择以硅胶薄层板的色谱行为为先导，被分离成分的Rf值一般在0.10.2为宜（理论上为0.20.3）。第21页/共68页“注”：展开剂和洗脱剂的选择最好参考文献资料。6)、更换洗脱剂 在一个洗脱剂系统下，一般要求至少洗脱35个保留体积，实验中可根据具体情况决定是否更换，比如到5个保留体积还有较大量的的物质被洗

8、脱下来，就应当继续洗脱下去。7)、保留体积的估算 浸泡硅胶的溶剂量 + 空柱溶剂量柱床上端溶剂量 =保留体积8)、流速的提高：柱上端加压或下段流出口减压，特别是填料硅胶粒度小时可采用这两种方式加快洗脱速度。9)、合并相同流份：硅胶薄层色谱指导合并，流份体积根据硅胶柱大小和分离样品量确定。第22页/共68页10、硅胶中低压柱色谱及高效液相色谱1)、流动相的选择： 通过硅胶薄层摸索液相色谱条件，最好用高效薄层指导来选择流动相，其粒度接近于制备色谱柱填料，用自制的硅胶薄层选择流动相时注意粒度和含有水分的影响。另外也可用同类型填料的分析柱摸索流动相条件。2)、样品溶液的处理： 尽可能选择流动相溶解样品

9、，并用微孔过滤器过滤。选择极性大于流动相的溶剂配制样品溶液会因进样量的不同影响保留时间和分离效果。3)、检测器的选择： 有紫外吸收的物质尽可能用紫外检测器，无紫外吸收的或紫外吸收较弱的可选用示差 检测器。目前出现的蒸发光散射检测器则是几乎对所有的非挥发性天然化合物适用。第23页/共68页11、硅胶干柱法（适用于有颜色或荧光的物质分离）干柱色谱的优点：1)、分离效果比湿装柱高。2)、洗脱液的选择可直接套用薄层色谱的最佳分离 条件。3)、常采用塑料薄膜柱，对有荧光或颜色的物质， 可借助紫外灯分割各色带，避免交叉。4)、适用于制备性分离。5)、设备简单，消耗溶剂少，节省时间。第24页/共68页硅胶干

10、柱法的操作1)、填充： 将硅胶填料（可用柱色谱硅胶）装入玻璃柱或透明塑料薄膜柱中，注意不要留有空隙。2)、上样： 将拌样硅胶均匀地加入柱的上端，并在拌样硅胶的上方加入与柱内径相同大小的原形滤纸。3)、展开： 将制备薄层展开剂条件直接用于干柱色谱上，配好足量的展开剂用分液漏斗滴加入柱中，待展开剂渗透到柱子的下端，即停止滴加。第25页/共68页4)、分割： 根据色带或荧光带做好标记，然后用弯勺取出各标记带对应的硅胶（玻璃柱），塑料薄膜柱可直接切割。5)、洗脱： 用合适的溶剂提取色带或荧光带硅胶，也可装入小玻璃柱用溶剂洗脱下来。“注意点”：a ：上样量比正常的硅胶柱色谱要少，一般1:1001:300

11、；b ：上柱硅胶的粒度越小效果越好，一般常用100140目的柱色谱硅胶，大的开放柱粒度要大些。第26页/共68页12、与硅胶相关的反相色谱填料常用的反相填料有RP-18(ODS)、RP-8和RP-2第27页/共68页13、反相分离色谱柱操作上的注意点1)、流动相为含水系统，同样可由相应的TLC确定柱色谱的分离条件，常用的有机溶剂有甲醇、乙腈、四氢呋喃。2)、柱色谱的填料最好以甲醇浸泡上柱，然后用甲醇洗脱23个保留体积，再用水置换出甲醇备用。3)、样品最好用流动相溶解，尽可能避免溶解在有机溶剂的比例大于流动相的溶液中。4)、对一些酸碱性物质，为了使峰形变锐，有时流动相加入少量的酸或水，或需配成缓

12、冲溶液（普通的反相色谱柱可耐受的pH为29），实验完毕冲洗柱子时一定要先用水，然后用醇。第28页/共68页常见高效液相色谱柱的种类第29页/共68页鉴定化合物纯度的方法1、熔点测定法2、薄层色谱法 3、高效液相色谱法4、核磁共振法4、电泳法第30页/共68页D1 cyclohexane:ethyl acetate(15:1)Minutes123456789Volts-0.050.000.050.100.150.20Volts-0.050.000.050.100.150.20Detector Aacb-53acb-53-60%-002Detector Aacb-531acb-531-60%-00

13、1Detector Aacb-532acb-532-60%-001Detector Aacb-535acb-535-60%-001Detector Aacb-536acb-536-60%-001Detector Aacb-537acb-537-60%-001HPLC结合TLC鉴定样品纯度实例第31页/共68页核磁共振法判断样品纯度第32页/共68页核磁共振法判断样品纯度第33页/共68页二、氧化铝相关色谱1、层析色谱用氧化铝规格和种类薄层：200300目柱层：60100目，100200目1)、碱性氧化铝：pH910，直接由氢氧化铝高温脱水制得。适用于对碱溶液比较稳定的中性色素、甾族化合物、生物

14、碱、醇以及其它中性、碱性物质的分离。2)、中性氧化铝：可由碱性氧化铝水洗至pH7.5，经活化制得。中性氧化铝使用最广，适于醛、酮、醌、某些苷及酸碱溶液中不稳定的化合物如酯、内酯等化合物的分离。3)、酸性氧化铝：加入2N盐酸处理，使水提液的pH为44.5，经活化制得。适用于酸性色素及某些醛酸的分离。第34页/共68页2、氧化铝的含水量与活性第35页/共68页3、氧化铝活性的测定细玻璃管法（展开剂：苯）第36页/共68页4、氧化铝的再生 用甲醇、稀醋酸、氢氧化钠溶液及水洗涤，再经高温活化后，可重复使用。5、氧化铝应用的局限性 一些酚性化合物（部分黄酮、香豆素类）、酸性物质（部分三萜酸）能与氧化铝结

15、合。此外，层析过程中引起的异构化、氧化、皂化、水合，以及脱氯化氢形成双键等反应，应引起操作者的注意。第37页/共68页第38页/共68页第39页/共68页第40页/共68页三、聚酰胺相关柱色谱1、聚酰胺的结构常用有锦纶6(聚己内酰胺)和锦纶66(聚己二酰己二胺)第41页/共68页2、聚酰胺的分离原理1) 反相色谱（流动相：含水溶剂）：a、氢键吸附：聚酰胺分子内的酰胺键，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键，因而产生吸附作用。b、非极性固定相：聚酰胺非极性脂肪链。2) 正相色谱（流动相：有机溶剂）：极性小的化合物先被洗脱下来，表现在薄层色谱上比移值较大。3、聚酰胺适用范围黄酮、酚类、蒽醌类

16、、萜类、甾体、生物碱、糖类等物质的分离；去鞣质。第42页/共68页4、聚酰胺的规格柱色谱聚酰胺 2040目，60100目，100200目薄层色谱聚酰胺 200300目5、聚酰胺粉的预处理 聚酰胺粉（锦纶）中常有两种杂质：原料单体、小分子聚合物和蜡质，在使用前需要预处理。操作方法： 1)、以90%95%的乙醇浸泡，搅拌，除去气泡后装入柱中，用醇洗至洗液透明并在蒸干后无残渣或极少量，一般至少洗脱34倍的体积。2)、依次用23倍体积的5%NaOH水溶液、2倍体积的蒸馏水、23倍体积的10%醋酸水溶液洗涤，最后用蒸馏水洗至中性。第43页/共68页6、聚酰胺柱色谱操作1) 装柱：以含水溶剂系统为洗脱剂，

17、常以水装柱（反相色谱）；若以有机溶剂系统为洗脱剂，常以极性较小的起始溶剂装柱（正相色谱）。2) 加样：100ml的聚酰胺可吸附1.52.5g。干法上样可参照硅胶柱色谱；湿法上样多用于反相色谱，样品溶于或至少均匀分散在水溶液中。3) 洗脱：根据聚酰胺薄层色谱结果确定柱色谱的条件。反相色谱一般用水、稀至浓的乙醇；正相色谱一般用氯仿、氯仿-甲醇的混合溶剂。4) 再生：5%NaOH洗涤至溶液颜色变淡，然后蒸馏水洗至pH89，再以2倍量10%醋酸洗脱，最后以蒸馏水洗至中性。第44页/共68页第45页/共68页第46页/共68页第47页/共68页 四、葡聚糖凝胶柱色谱1、交联葡聚糖的化学结构第48页/共6

18、8页2、常用葡聚糖凝胶种类、分离原理 Sephadex G 系列分子筛第49页/共68页葡聚糖凝胶G系列的性质第50页/共68页Sephadex LH20分子筛和反相分配色谱 羟丙基交联葡聚糖凝胶，吸水量每克2ml。可在水和有机溶剂中使用，洗脱剂的选择从被分离物质的性质和溶解度两方面考虑。第51页/共68页3、葡聚糖凝胶柱色谱的操作Sephadex LH201)、柱子的选择 细长柱(长11.5m，直径23cm)2)、 浸泡 用上柱的洗脱溶剂浸泡34小时（分离小分子的G-10、15和LH20），然后搅拌排气泡。3)、 装柱 空柱加洗脱液1/4左右，尽可能一次性加入所有凝胶，沉降、平衡至柱床不再下

19、降为止。柱床越高，分离效果越好。第52页/共68页4)、加样 待液面离柱床表面12mm时，用滴管加入样品溶液（洗脱剂溶解），样品溶液要尽量体积小、浓度大。5)、洗脱 洗脱剂的选择根据上柱样品的性质和样品的溶解度。分离中性物质可选择水、电解质和缓冲液；对阻滞较强的组分，可选择含水有机溶剂，或单用有机溶剂。6)、收集和检出 带有颜色的物质可根据外观色带判断； 有强UV吸收的物质可用紫外灯照射来区分色谱带； 无或较弱紫外吸收的物质可用薄层色谱行为判断。7)、再生 用0.5N 氢氧化钠和0.5N氯化钠混合液浸泡，再用水洗至中性。第53页/共68页第54页/共68页第55页/共68页Sephadex G系列在操