水稻淀粉合成相关基因研究

1、向珣朝西南科技大学水稻品质是指稻谷和稻米的质量，直接关系到水稻生产的经济效益和人民的生活水平。根据优质稻谷国标GB/T17891-1999，稻谷和稻米品质包括加工品质、外观品质、蒸煮食味品质、营养品质等。其中最重要的是外观品质和蒸煮食味品质；外观品质决定稻米的商品性，蒸煮食味品质决定口感的好坏。5/22/20122Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology外观品质鉴定相对简单；蒸煮食味品质(eating and cooking qualities, ECQs)包括直链淀粉含量(Amylose Content, AC)

2、、胶稠度(gel consistency, GC)和糊化温度(gelatinization temperature, GT)，ECQs是稻米品质中最重要也是最复杂的指标，传统鉴定方法相对繁杂。优质稻米一般具有适中的表观直链淀粉含量优质稻米一般具有适中的表观直链淀粉含量 (Apparent Amylase Content，AAC)，高的，高的GC和低的和低的GT。11/1/20213Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology一、高等植物淀粉的生物合成协同完成的酶有：1. ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP glucose

3、 pyrophosphorylase，AGP)；2. 淀粉合成酶(starch synthase，SS)；3. 淀粉分支酶(Starch Branching Enzyme，SBE)；4. 淀粉脱支酶(Starch Debranching Enzyme，DBE) 。每一种酶有多种同工型。11/1/20214Xunchao Xiang Southwest University of Science and TechnologyMain pathway of starch biosynthesis including sucrose synthesis, sucrose degradation an

4、d starch synthesis in riceFBP1,fructose-1,6-bisphophatase1; PGM, phosphoglucomutase; AGPase, ADP-glucose pryophosphorylase; PPi, pyrophosphate.11/1/20215Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology淀粉合成酶(starch synthase，SS)根据在提取液中与淀粉粒的结合程度不同，分为颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）与可溶性淀粉合成酶（SSS）两类，前者与淀粉粒紧密结

5、合在一起，而后者与淀粉粒结合程度较弱。淀粉合成酶以ADPG为底物催化形成-1,4糖苷键，从而线性延长葡聚糖链。11/1/20216Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology稻米淀粉合成相关的主要5大类酶：1. ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase)2.颗粒结合淀粉合成酶(granule binding starch synthase，GBSS)3.可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase，SSS)4.淀粉分支酶(starch bra

6、nching enzyme，SBE)5.脱分支酶(debranching enzyme，DBE)各类酶又存在数目不等的同工型(isoforms)， 编码以上酶的基因有近20 个之多， 各个基因在淀粉合成的不同阶段起着不同的作用。11/1/20217Xunchao Xiang Southwest University of Science and TechnologySimplified starch synthesis system in cereal11/1/20218Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology11

7、/1/20219Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology1. ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase)AGP催化淀粉合成中的第一个反应，产生有活性的供体ADP-葡萄糖(ADP-glucose，ADPG)。AGP有两个大亚基和两个小亚基组成，分别由两个基因编码。AGP有两种存在场所：细胞质和质体。谷类作物的胚乳中，大部分(8595%)存在于细胞质中。11/1/202110Xunchao Xiang Southwest University of Scienc

8、e and Technology2.颗粒结合淀粉合成酶(granule binding starch synthase， GBSS)GBSS有两种同工型：GBSSI和GBSSII。GBSSI由Waxy (Wx) 基因编码，它的主要功能是合成直链淀粉。GBSSII的主要功能是在果皮等非储藏器官中合成临时性的直链淀粉。Wx 基因变异是导致水稻直链淀粉含量变异最主要的原因。目前在Wx 座位上已经发现存在5 种复等位基因(Wxa, Wxb, Wxop, Wxin 和wx) ，分别存在于普通籼稻、粳稻、云南软米品种、美国长粒粳稻Lemont和糯稻中。11/1/202111Xunchao Xiang So

9、uthwest University of Science and TechnologyThe structure of the Wx gene of riceRegion A is 867 bp (aligned length) including the 5 splice junction of intron 1 and p-SINE1-r1, and region B is 3,455 bp (aligned length) including the coding regions, p-SINE1-r2 and Tnr-1.11/1/202112Xunchao Xiang Southw

10、est University of Science and TechnologyWxb 与Wxa 相比， 第1内含子+1位碱基由G 变为T，降低了Wx 基因转录后mRNA 的剪接效率；Wxop 与Wxa 相比，在第4 外显子的A762 突变为G762，导致氨基酸由Asp 变为Gly； 而Wxin 与Wxa 相比， 则是在第6 外显子中的A1132 突变为C1132， 其编码的氨基酸由Tyr 变为Ser；在Wx 基因的第2 外显子中23 bp 的插入，导致终止密码子提前出现，是形成wx 等位基因的根本原因。11/1/202113Xunchao Xiang Southwest University

11、 of Science and Technology3.可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase，SSS)SSS主要分布在质体基质，催化支链淀粉 -1,4-糖苷键的形成，它有多种同工型。可溶性淀粉合成酶包括SSS1、SSSII、SSSIII和SSSIV，它们主要参与支链淀粉的合成。SSSII有同工型SSSII-1、SSSII-2、SSSII-3；SSSIII有同工型SSSIII-1、SSSIII-2；SSSIV有同工型SSSIV-1、SSSIV-2；11/1/202114Xunchao Xiang Southwest University of Science and

12、TechnologySSS1主要负责合成短链，也即小于10个葡萄糖单位的链；进一步的延伸由SSSII和SSSIII负责；在进一步延伸之前，可能引入了分支。SSSII为支链淀粉晶体构建所必需，它负责合成支链淀粉分支簇的主要成分中等长度的葡聚糖链，对分支簇内短链(A和B1链)延伸、B2和B3链合成起明显作用，促进晶体层的形成，影响淀粉的晶体模式11/1/202115Xunchao Xiang Southwest University of Science and TechnologySSS 与SSS相比，更倾向于合成长的B1和B2链 (DP=2535)(Edwards等，1999)。只在一个分支簇

13、内出现的B链称B1链，连接2和3个分支簇的B 链分别称B2和B3链。11/1/202116Xunchao Xiang Southwest University of Science and TechnologySchematic representation of the gene that codes for rice starch synthase IIa (SSIIa) showing the positions of exons, introns and single nucleotide polymorphisms (SNPs).11/1/202117Xunchao Xiang So

14、uthwest University of Science and TechnologySchematic representation of starch synthase IIa (SsIIa) showing the location of nonsynonymous polymorphisms observed in cultivated rice.The boxes represent exon regions: shaded regions are translated, and nonshaded regions are transcribed but not translate

15、d. Lines connecting boxes correspond to intron regions. The sizes of the gene and sequenced region are indicated above the boxes. The numbers 1, 2 and 3 indicate the locations of single nucleotide polymorphisms (SNPs) 1, 2 and 3 analyzed for phenotypic associations. Bold italic sequences indicate co

16、dons with nonsynonymous mutations.11/1/202118Xunchao Xiang Southwest University of Science and TechnologyGao 等人用图位克隆法获得了控制稻米糊化温度的基因ALK(SSII-3)， 推测在翻译起始密码子ATG 下游的G264 突变为C264 与糊化温度的高低有关；Bao 等人对30 个品种中SSIIa(SSII-3)基因中一段包括内含子6， 7 和外显子6， 8， 以及部分3非翻译区的核苷酸序列进行了测序分析， 结合关联分析检测到在第8 外显子中GC/TT 的变异对糊化温度的变异具有较大的

17、影响。11/1/202119Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology4.淀粉分支酶(starch branching enzyme，SBE)SBE的功能是通过断开内部的-1,4糖苷键并把释放出来的还原性末端转移到C6羟基上，从而产生-1,6糖苷键。根据转移的链长度可分为两类：SBEI和SBEII。SBEI倾向于转移长链，SBEII 倾向于转移短链。淀粉分支酶至少有3 种同工型, 即SBE 1, SBE 3 和SBE 4。11/1/202120Xunchao Xiang Southwest University of

18、 Science and Technology5.脱分支酶(debranching enzyme，DBE)植物中存在着两种类型的DBE，异淀粉酶（isoamylase）和极限糊精酶(pullulanase)，它们的功能都是水解-1,6糖苷键，但它们的底物特异性不同。目前，脱分支酶(isoamylase和pullulanase)在淀粉合成中的确切功能还不清楚。11/1/202121Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology二、什么是RVA？稻米淀粉粘滞性一般用淀粉粘滞谱(又称RVA谱)来表示，是指稻米淀粉匀浆在加热、持

19、续高温和冷却过程中粘度随之变化而形成的曲线。稻米RVA谱是指稻米淀粉与一定量的水混合后，米浆在不同温度下的黏度变化曲线。它可以比较灵敏地反映不同品种间淀粉的品质差异。11/1/202122Xunchao Xiang Southwest University of Science and TechnologyRVA特征指标：一级指标：最高粘度(peak viscosity，PKV)、热浆粘度(hot paste viscosity，HPV)和冷胶粘度(cool paste viscosity，CPV)。二级指标：崩解值(breakdown value，BDV，=PKV-HPV)、消减值(setb

20、ack value，SBV，=CPV-PKV)和回复值(consistency value，CSV，=CPV-HPV) 。11/1/202123Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology最高粘度(PKV, peak viscosity)是由于充分吸水膨胀后的淀粉粒(又称膨润粒)互相摩擦而使米浆粘度增加所达到的最高值，它反映了淀粉的膨胀能力；热浆粘度(HPV, hot paste viscosity)是由淀粉粒膨胀至极限后破裂，米浆粘度急剧下降所达到的值，它反映了淀粉在高温下耐剪切能力，是影响食品加工操作难易的因素之一

21、；11/1/202124Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology冷胶粘度(CPV , cool paste viscosity)是在温度降低后被直链淀粉和支链淀粉包围的水分子运动变弱而使米浆粘度再度上升后所达到的数值，冷胶粘度大则意味着室温状态下米浆粘度高，稻米煮成的饭就硬，具有这种特性的米煮成的饭也较硬。11/1/202125Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology澳大利亚的Newport scientific Instrument公

22、司开发的粘度速测仪(RVA)，在谷物的淀粉粘度测定领域得到广泛使用，许多研究表明，它用于评价稻米品质是可行的。RVA仪用TCW配套软件进行分析，具有快速、简单、准确、重复性好等特点，而且RVA测定条件模拟稻米蒸煮过程，测定的RVA谱更能贴切地反映米饭口感和质地，因而可望成为评价稻米食味品质的适用技术。11/1/202126Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology稻米淀粉RVA谱主要受Wx基因控制(包劲松, 等, 1999)。由于稻米ECQs的主要指标与RVA谱中除PKV外的其余特征值相关极显著(贾良, 等, 200

23、8; 隋炯明, 等, 2005)，特别是BDV与GC的关系接近直线相关，AC和GC与RVA特征值相关系数分别高达0.919和0.905，RVA预测值与分析值十分接近(胡培松, 等, 2004)，因此，用RVA谱分析不同稻米的ECQs准确可行。11/1/2021Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology27Summary of genes controlling rice grain ECQs (eating and cooking qualities)AC amylose content; GC gel consis

24、tency; GT gelatinization temperature.11/1/202128Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology三、研究现状研究表明,不同品种AC 的高低由该品种Wx 基因第1 内含子的剪接效率所决定,而Wx 基因第1 内含子的剪接效率又与第1 内含子中供体+ 1 位的碱基是正常的G 或是突变的T 有关。蔡秀玲等利用该位点上的G/T 变异设计了可区分两种基因型的“PCR-AccI”分子标记， 而将Wx基因型分为GG型、TT型或GT型，其对应的基因型分别为WxaWxa， WxbWxb和WxaW

25、xb。11/1/202129Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology孙华钦等建立了能用水平凝胶电泳检测基因Wa、Wb的显性STS标记：W i10-2和W i10-1。11/1/202130Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology吴洪恺认为：在其研究的4 种基因(即SssI 、SssII-3 、SssIII-1 和Sbe1)中，效应最为明显的为SssII-3 。表现在该基因被苏御糯的相应基因置换以后形成的品系13，其RVA谱的主要特征值比

26、糯稻品系11 更接近于亲本苏御糯。表现在热胶黏度、冷胶黏度和崩解值等特征值上。11/1/202131Xunchao Xiang Southwest University of Science and TechnologyAssociated genes affecting ECQ（eating and cooking quality）in the rice starch biosynthesis pathway. The genes marked in red were significant. Two major genes, Wx and SSII-3, were circled. ASV

27、 (alkali spreading value ) GT11/1/202132Xunchao Xiang Southwest University of Science and TechnologyWx and SSII-3 are central in determining grain ECQs by affecting all three properties: AC, GC, and GT. Wx functions as the sole major gene for both AC and GC but as a minor gene affecting GT, whereas

28、SSII-3 is the sole major gene controlling GT but as a minor gene affecting AC and GC.11/1/202133Xunchao Xiang Southwest University of Science and TechnologyTwo genes affect two properties simultaneously: both ISA and SBE3 affect GC and GT.Several minor genes are specific for each property: SSIII-2,

29、AGPlar, PUL, and SSI for AC, AGPiso for GC, and SSIV-2 for GT.The correlations among AC, GC, and GT were caused by the joint action of these associated genes and unequal haplotype combination. 11/1/202134Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology Haplotype=？Haplotype, a contraction

30、 of “haploid genotype”, is the genetic constitution of an individual chromosome. Haplotype may refer to only one locus or to an entire genome. In a second meaning, haplotype is a set of single nucleotide polymorphisms (SNPs) on a single chromatid that are statistically associated. It is thought that

31、 these associations, and the identification of a few alleles of a haplotype block, can unambiguously identify all other polymorphic sites in its region.11/1/2021Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology35Effects of Wx and SSII-3 on grain ECQs in rice. (A) Wx functions as a major g

32、ene controlling AC. (B) Wx functions as a major gene controlling GC. (C) SSII-3 functions as a major gene controlling GT. (D) SSII-3 also functions additively with Wx to control grain AC. (E) Wx works with SSII-3 in controlling grain GT. (F) The haplotype combination of Wx and SSII-3. 11/1/202136Xun

33、chao Xiang Southwest University of Science and Technology Wx基因变异是导致水稻AC变异最主要的原因目前Wx基因的序列变异已经发现存在于：(1)Wx基因5端非翻译区第一外显子CT多态性 (CTn) alleles) (Bligh et al., 1995)；(2)Wx基因第一内含子G/T多态性(In1G/T SNP) (Cai et al., 1998)；(3)Wx基因第四外显子A/G多态性(Ex4A/G SNP) (Mikami et al., 2008)；(4)Wx基因第六外显子A/C多态性(Ex6A/C SNP)；(5)第10外显

34、子的C/T多态性(Ex10C/T SNP) (Larkin and Park, 2003)。11/1/2021Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology37现有水稻资源中出现的四个单倍型In1G-Ex6A(高AAC)、In1G-Ex6C(中等程度的AAC)、In1T-Ex6A(低AAC)、In1T-Ex6C(仅存在于糯稻)对ECQs改良具有指导作用。11/1/2021Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology38通过对现有水稻资源Wx基因等

35、位变异检测和其直链淀粉含量的相关分析，发现In1G/T SNP和Ex6A/C SNP二个位点变异对水稻胚乳直链淀粉含量影响最大(Chen et al., 2008a, 2008b)。11/1/2021Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology39 SSSII-3(SSSIIa)基因变异是导致水稻GT变异最主要的原因目前SSSII-3基因的序列变异已经发现存在于：(1)SSSII-3基因的第一外显子(Ex1G/C SNP, Glu/Asp)；(2)第八外显子(Ex8A/G SNP, Ser/Gly)；(3)第八外显子(

36、Ex8A/G SNP, Met/Val)；(4)第八外显子(Ex8GC/TT, Leu/Phe) (Umemoto et al., 2004)。11/1/2021Xunchao Xiang Southwest University of Science and Technology40现有水稻资源中发现四个单倍型：单倍型1(Ex8G/ Ex8G/ Ex8GC)和单倍型2(Ex8A/ Ex8G/ Ex8GC)有高的GT，单倍型3(Ex8A/ Ex8A/ Ex8GC)和单倍型4(Ex8A/ Ex8G/ Ex8TT)有低的GT(Umemoto et al., 2005; Waters et al., 2006)。11/1/2021Xunchao Xiang S