微生物法转化异丁香酚生成香草醛的研究

1、微生物法转化异丁香酚生成微生物法转化异丁香酚生成香草醛的研究香草醛的研究研究生：赵丽青研究生：赵丽青导导 师：孙志浩师：孙志浩2005.10.282005.10.28研究报告研究报告vzhao li-qing, sun zhi-hao, zheng pu, zhu lei-lei. biotransformation of isoeugenol to vanillin by a novel strain, bacillus fusiformis. biotechnology letters. 2005, 27: 15051509 香香 草草 醛醛别名：香兰素、香草素、香兰醛，别名：香兰素、香草

2、素、香兰醛，香茅醛，香茅醛，3-3-甲基原儿茶醛甲基原儿茶醛 最重要的香味物质之一，广泛应最重要的香味物质之一，广泛应用于食品、饮料、香料、医药等用于食品、饮料、香料、医药等各领域各领域 市场来源：天然香草醛市场来源：天然香草醛 合成香草醛合成香草醛 合成香草醛合成香草醛丁香精半合成法丁香精半合成法松柏苷水解法松柏苷水解法丁香酚丁香酚法法黄樟素法黄樟素法愈创木酚法愈创木酚法对羟基苯甲醛法对羟基苯甲醛法木质素法木质素法对甲酚法对甲酚法邻苯二酚法邻苯二酚法电解合成法电解合成法v最常见：最常见：v愈创木酚法愈创木酚法v木质素法木质素法v年产：年产：10 000 tv市场价格市场价格 us$ 11 k

3、g-1 天然香草醛天然香草醛香荚兰豆提取法香荚兰豆提取法主要生产地：马达加斯加、科摩洛岛、塔希提主要生产地：马达加斯加、科摩洛岛、塔希提岛、墨西哥、印度尼西亚、留尼旺、塞古尔、岛、墨西哥、印度尼西亚、留尼旺、塞古尔、毛里求斯毛里求斯我国：云南、海南我国：云南、海南年产：年产：20 t；约；约 us$ 3 000 kg-1 植物细胞培养法植物细胞培养法未见商业化生产报道未见商业化生产报道 生物转化法生物转化法生物香兰素生物香兰素指利用真菌、细菌、植物细胞、酶或基因工程指利用真菌、细菌、植物细胞、酶或基因工程菌生物转化木质素、丁子香酚、异丁子香酚等菌生物转化木质素、丁子香酚、异丁子香酚等天然化合物

4、前体物，生物合成的香草醛天然化合物前体物，生物合成的香草醛 随着消费者对健康的关注及美国和欧盟的规定，随着消费者对健康的关注及美国和欧盟的规定，天然香兰素的市场需求日益增长天然香兰素的市场需求日益增长生物香兰素是最佳的天然提取香兰素的替代品生物香兰素是最佳的天然提取香兰素的替代品其其在生产规模上一旦形成优势可取代人工合成在生产规模上一旦形成优势可取代人工合成的香草醛的香草醛 生物技术法生物技术法前体物质：木质素、丁香酚、异丁香酚、前体物质：木质素、丁香酚、异丁香酚、香草醇、香草胺、松柏醇、阿魏酸、芳香香草醇、香草胺、松柏醇、阿魏酸、芳香族氨基酸等族氨基酸等阿魏酸两步法阿魏酸两步法（商业化，（商

5、业化， us$ 600 kg-1 ）主要问题：底物价格较高，生成产物过程主要问题：底物价格较高，生成产物过程复杂，副产物较多复杂，副产物较多 丁香酚丁香酚/异丁香酚法异丁香酚法异丁香酚异丁香酚 och3ohch=ch-ch3 丁香酚丁香酚 ch2ch=ch2 och3 oh 酶转化法酶转化法1990年年，yoshimoto 等人等人，分离出一种苯乙烯双氧分离出一种苯乙烯双氧酶酶，并从相应的苯乙烯和异丁香酚转化生成香草醛并从相应的苯乙烯和异丁香酚转化生成香草醛1993年，年，markus提出用脂氧合酶以异丁香酚和丁香提出用脂氧合酶以异丁香酚和丁香酚为底物酶法制备香草醛酚为底物酶法制备香草醛199

6、4年，年，mane和和zucca用脂氧化合酶从丁香酚、异用脂氧化合酶从丁香酚、异丁香酚或松柏醇制备香草醛并得到最高浓度达丁香酚或松柏醇制备香草醛并得到最高浓度达22.8 g l-1的香草醛的香草醛酶转化法酶转化法主要问题主要问题易受季节及大豆来源、批次等的影响，生易受季节及大豆来源、批次等的影响，生产及研究不够稳定产及研究不够稳定 微生物转化法微生物转化法香草醛浓度普遍偏低香草醛浓度普遍偏低further transferredreasonsproduct inhibitionsubstrate inhibitionvanillinvanillic acid微生物菌株的筛选微生物菌株的筛选 土

7、样 增殖培养 以异丁香酚为唯一碳源的选择性平板培养 挑选不同培养特征的菌落至斜面 初筛 复筛， 香草醛降解实验 菌株纯化分离 香 草 醛 产 生 菌（出发菌株） 各菌株转化异丁香酚生成香草醛能力各菌株转化异丁香酚生成香草醛能力 v反应液反应液（g/l） 异丁香酚异丁香酚 20 k2hpo4 3h2o 14 kh2po4 5.2v ph 7.0，28， 180 r/min，3 d hplc测定测定各菌株降解香草醛能力各菌株降解香草醛能力 v反应液（反应液（g/l） 香草醛香草醛 2 k2hpo4 3h2o 14 kh2po4 5.2vph 7.0 ，28，180 r/min，3 d 反应液总组分

8、反应液总组分gc-ms图谱图谱relative abundance o h och3 cho och3 oh ch=ch-ch3 rt/mincompoundsarea %16.09isoeugenol11.6016.92isoeugenol56.9118.83vanillin13.82sw-b9 sw-b9 在异丁香酚存在时的生长情况在异丁香酚存在时的生长情况sw-b9sw-b9对香草醛的降解情况对香草醛的降解情况菌种鉴定菌种鉴定v生理生化鉴定生理生化鉴定v16s rrna序列分析序列分析 形态观察形态观察v 前期细胞前期细胞 产芽孢细胞产芽孢细胞 成熟芽孢成熟芽孢 tem照片照片 1 m1

9、 m 细胞与周身鞭毛细胞与周身鞭毛 细胞及端生芽孢细胞及端生芽孢 16s rrna序列分析序列分析提取细胞总提取细胞总dnapcr扩增扩增 p1 (5agagtttgatcctggctcag3) p2 (5aaggaggtgatccagccgca3) 获得获得1525 个碱基对个碱基对pcr产物直接测序（宝生物工程（大连）有限产物直接测序（宝生物工程（大连）有限公司）公司）该序列与该序列与genbank中相关数据进行相似性分析中相关数据进行相似性分析 sw-b9及其从及其从genbank数据库中相关数据库中相关属种构建的系统树属种构建的系统树 0.02 filibacter limicola

10、dsm 13886t (aj292316) bacillus macroides lmg 18474 (aj628749) bacillus silvestris hr3-23 (aj006086) bacillus sphaericus b3 (aj311893) sw-b9 bacillus fusiformis dsm 2898t (aj310083) caryophanon tenue dsm 14151 (aj491302) caryophanon latum dsm 14152 (aj491303) 100 88 98 100 100 两相转化体系的建立两相转化体系的建立菌株菌株sw-b9sw-b9在两相体系与单相体系下在两相体系与单相体系下的转化能力对比的转化能力对比主要结论主要结论v从土壤中筛选获得了性能优异的菌株从土壤中筛选获得了性能优