23-重组DNA技术ppt课件

1、1重组重组DNA技术（基因工程）技术（基因工程）l基因工程l基因工程的风险和伦理学问题 2基因工程基因工程l基因工程概述l基因工程的相关技术l基因工程的工具酶l载体l基因工程的基本步骤l基因工程的应用3基因工程的概念基因工程的概念genetic engineeringl基因工程一般可分为广义和狭义的两种。广义的基因工程包括：整体水平，如生物的有性杂交；细胞水平，如细胞融合；分子水平，染色体工程、基因克隆等。狭义的基因工程即是通常讲的基因克隆。l目的: 是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并能稳定遗传。4基因工程的概念基因工程的概念genetic engineeringl定义： 又称

2、为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。基因工程是采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段建立起来的基因操作技术。 5基因工程重要特征：基因工程重要特征：l可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状l某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能6基因工程技术路线基因工程技术路线lDNA片段的取得（目的基因的分离和制备）lDNA片段和载体的连接重组体DNAl外源DNA片段引入受体细胞基因克隆和基因

3、文库l筛选目的克隆 l基因表达与产物分离78基因工程的相关技术基因工程的相关技术l核酸的分子杂交l聚合酶链式反应(polymerase chain reaction): PCR和RT-PCR (reverse transcription PCR)9核酸的分子杂交核酸的分子杂交lSouthern blot-DNAlNorthern blot-RNAlIn situ hybridizationlFluorescent In situ hybridization10Southern blot1112analysis of BLTR mRNA13Tracing and Assaying Molecul

4、es Inside CellsIn situ hybridization for RNA localization in tissues. 14Fluorescent In situ hybridization15聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)l聚合酶链式反应是体外快速扩增聚合酶链式反应是体外快速扩增DNA的方法的方法 l PCR反应包括三个步骤：反应包括三个步骤：l变性变性(denature)：在：在94-95使模板使模板DNA的双链变性成单链的双链变性成单链l低温退火低温退火(annealing)：两个引物分别与单链：两个引物分别

5、与单链DNA互补复性互补复性l延伸延伸(extension)：在引物的引导及：在引物的引导及Taq酶的作用下，于酶的作用下，于72合成模板合成模板DNA的的l这三个步骤称为一个循环，这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有反应常有25-35个循环个循环161718RT-PCR192021限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶l限制性内切核酸酶或限制性酶限制性内切核酸酶或限制性酶(restriction enzymes)是细菌中这些酶的是细菌中这些酶的功能是降解外来功能是降解外来DNA分子的一类酶。以限制分子的一类酶。以限制(restriction )或阻止病毒侵或阻止病毒侵染染限制性酶据其作用特点，可

6、分为两类限制性酶据其作用特点，可分为两类第第类限制性酶每隔一段类限制性酶每隔一段DNA序列随机切割双链序列随机切割双链DNA分子，没有序列特分子，没有序列特异性异性第第类限制性酶能识别一段特异的类限制性酶能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链序列，准确地酶切双链DNA的特的特异序列。第异序列。第类限制性酶识别的序列是对称的，即在一条链中从类限制性酶识别的序列是对称的，即在一条链中从5到到3方向的序列，与其互补链从方向的序列，与其互补链从5到到3方向的序列完全相同。这种从两个方方向的序列完全相同。这种从两个方向阅读而序列相同的序列称为回纹对称序列向阅读而序列相同的序列称为回纹对称序列(pal

7、indrome)22限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶23粘性末端粘性末端平整末端平整末端24其它工具酶其它工具酶lT4 DNA连接酶(ligase)l反转录酶（reverse transcriptase)25载体载体(vector)l一个DNA片段只有与适合的载体(vector) DNA连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下，才可以高效率地进入宿主细胞(host cell)，并在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体（BAC、YAC）等26载体载体DNA分子，需要具备：分子，需要具备：l具复制原点具复制原点(ori)，在宿主细胞中不仅

8、能独立地自我复制，而且能带动携带的外，在宿主细胞中不仅能独立地自我复制，而且能带动携带的外源源DNA片段一起复制片段一起复制l具有多克隆位点具有多克隆位点(multiple cloning site, MCS)，而每一种酶的切点只有一个，用，而每一种酶的切点只有一个，用于克隆外源于克隆外源DNA片段。这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基因内片段。这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基因内l至少具有一个选择标记基因，使有或无载体的宿主细胞具有易鉴别的表型至少具有一个选择标记基因，使有或无载体的宿主细胞具有易鉴别的表型l易从宿主细胞中回收。易从宿主细胞中回收。 较小的相对分子量和较高

9、的拷贝数较小的相对分子量和较高的拷贝数l安全性安全性27载体载体(vector)的种类的种类l细菌质粒载体细菌质粒载体l噬菌体噬菌体l柯斯质粒柯斯质粒(cosmid)l穿梭载体穿梭载体l酵母人工染色体（酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）lTi质粒质粒28细菌质粒载体细菌质粒载体质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链的环状双链DNA分子分子这些质粒的适应范围广，拷贝数多。进入宿主细胞复制后，每个细胞的质粒拷贝这些质粒的适应范围广，拷贝数多。

10、进入宿主细胞复制后，每个细胞的质粒拷贝数可高达数可高达1000个个早期用于基因工程的载体是经遗传改良的细菌质粒，它们仅能用于克隆分子量小早期用于基因工程的载体是经遗传改良的细菌质粒，它们仅能用于克隆分子量小于于10kb( 1000bp =1kb)的外源的外源DNA片段片段现在广泛使用且商品化的质粒，很多都具有重组表型检测标记，在现在广泛使用且商品化的质粒，很多都具有重组表型检测标记，在DNA克隆中克隆中根据宿主细胞的表型即可推知质粒是否携带外源根据宿主细胞的表型即可推知质粒是否携带外源DNA片段片段293031噬菌体噬菌体 噬菌体基因组全长噬菌体基因组全长49kb。噬菌体噬菌体DNA中中间约三

11、分之二的序列为中间基因簇，位于两端间约三分之二的序列为中间基因簇，位于两端的为的为DNA左、右臂。左、右臂。基因组的中间基因簇序基因组的中间基因簇序列可被外源列可被外源DNA片段取代片段取代, 而不影响噬菌体感而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力染细菌及形成噬菌斑的能力 噬菌体载体可接受噬菌体载体可接受15 kb-23 kb的外源的外源DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，在基因库筛选中，体，在基因库筛选中，噬菌体作载体与细菌噬菌体作载体与细菌质粒相比，具有易操作、阳性克隆数多等特点，质粒相比，具有易操作、阳性克隆数多等特点，现广泛用于各

12、类基因库的构建现广泛用于各类基因库的构建 32柯斯质粒柯斯质粒(cosmid) 柯斯质粒柯斯质粒(cosmid)是利用部分是利用部分噬菌体噬菌体DNA与部分细菌质粒与部分细菌质粒DNA序列组建而成的序列组建而成的 具有具有噬菌体的噬菌体的cos序列序列(12bp) 和细菌质粒的复制原点。和细菌质粒的复制原点。cos序列是噬菌体序列是噬菌体DNA包装成噬包装成噬菌体时所必需的，而质粒的复菌体时所必需的，而质粒的复制原点可使柯斯质粒在细菌细制原点可使柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样自主胞中同普通细菌质粒一样自主复制。复制。 可接受长达可接受长达50kb的外源的外源DNA片段片段33 穿梭载体

13、是指能在两种不同的生穿梭载体是指能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原物中复制的载体。例如既能在原核生物核生物(如大肠杆菌如大肠杆菌)中复制，又中复制，又能在真核细胞能在真核细胞(如酵母如酵母)中复制的中复制的载体载体不仅具有细菌质粒的复制原点及不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列以及选择标记性状，自主复制序列以及选择标记性状，具有多克隆位点具有多克隆位点穿梭载体穿梭载体34酵母人工染色体（酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）35u根瘤细胞的形成是因为土壤农根瘤细胞的形成是因为土壤农杆

14、菌中存在着一种诱导瘤细胞杆菌中存在着一种诱导瘤细胞(tumor- inducing, Ti)的质粒，的质粒，这种质粒被称为这种质粒被称为Ti质粒质粒uTi质粒的一部分质粒的一部分DNA叫做转移叫做转移DNA(transfer DNA,T-DNA)u当当T-DNA整合到宿主植物细胞整合到宿主植物细胞的染色体后，就诱导出根瘤，的染色体后，就诱导出根瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱并使根瘤细胞合成冠瘿碱(opine), 作为土壤农杆菌的碳源作为土壤农杆菌的碳源和氮源和氮源 Ti质粒质粒36基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤l基因的获得基因的获得l阳性克隆的分析与鉴定阳性克隆的分析与鉴定l目的基因与载体连

15、接目的基因与载体连接(DNA分子重组分子重组)l目的基因导入受体目的基因导入受体l产品表达和纯化产品表达和纯化37基因的获得基因的获得(一一) 从基因库中分离基因从基因库中分离基因 大多数方法是利用一段核苷酸序列作探针大多数方法是利用一段核苷酸序列作探针(probe)，用放射性同位素或非放射，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库如菌斑杂交法如菌斑杂交法(plaque hybridization)筛选筛选噬菌体核基因库噬菌体核基因库(二二) 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)扩增基因扩增基因(三三) 人工合成基因人

16、工合成基因 (四四) RT-PCR38阳性克隆的分析与鉴定阳性克隆的分析与鉴定限制性酶图谱限制性酶图谱39阳性克隆的分析与鉴定阳性克隆的分析与鉴定核酸序列分析核酸序列分析40目的基因与载体连接目的基因与载体连接(DNA分子重组分子重组)41DNA分子重组分子重组42目的基因导入受体目的基因导入受体43植物基因工程过程植物基因工程过程44小结小结45在基础研究中的应用在基础研究中的应用在农业和工业上的应用在农业和工业上的应用在医学中的应用：在医学中的应用：l基因工程用于生产蛋白质类药物基因工程用于生产蛋白质类药物l基因工程用于疫苗生产基因工程用于疫苗生产l基因工程用于基因治疗基因工程用于基因治疗

17、l遗传疾病诊断遗传疾病诊断 RFLP 法法基因工程的应用基因工程的应用46在农业和工业上的应用在农业和工业上的应用1.增加农作物产品的营养价值，如增加种子、块茎的蛋白质含量，改变植物蛋增加农作物产品的营养价值，如增加种子、块茎的蛋白质含量，改变植物蛋白的必需氨基酸比例等白的必需氨基酸比例等2.提高农作物抗逆性能如：抗病虫害、抗旱、抗涝、抗除草剂等性能提高农作物抗逆性能如：抗病虫害、抗旱、抗涝、抗除草剂等性能3.提高光合作用效率将是提高农作物产量的一个有效方法提高光合作用效率将是提高农作物产量的一个有效方法4.生物固氮的基因工程。若能把禾谷等非豆科植物转变为能同根瘤菌共生，或生物固氮的基因工程。

18、若能把禾谷等非豆科植物转变为能同根瘤菌共生，或具固氮能力，将代替无数个氮肥厂具固氮能力，将代替无数个氮肥厂47在农业和工业上的应用在农业和工业上的应用 5. 增加植物次生代谢产物产率。植物次生代谢产物构成全世界药物原料的增加植物次生代谢产物产率。植物次生代谢产物构成全世界药物原料的 25% ，如治疗疟疾的奎宁、治疗白血病的长春新碱、治疗高血压的东莨菪碱、作为麻醉剂如治疗疟疾的奎宁、治疗白血病的长春新碱、治疗高血压的东莨菪碱、作为麻醉剂的吗啡等的吗啡等6. 运用转基因动物的技术，可培育畜牧业新品种运用转基因动物的技术，可培育畜牧业新品种7.“吃油吃油”工程菌工程菌8. 纤维素酶纤维素酶48 不易

19、腐烂的番茄不易腐烂的番茄 动物植物的遗传改良动物植物的遗传改良抗虫植物抗虫植物 化学农药化学农药兔毛棉花在我国培育成功：用兔的一种角蛋白转兔毛棉花在我国培育成功：用兔的一种角蛋白转化棉花，棉花纤维质量好，具有兔毛般的光泽化棉花，棉花纤维质量好，具有兔毛般的光泽49抗虫棉花抗虫棉花50Swiss researchers have produced rice capable of synthesizing beta-carotene, the precursor of Vitamin A (Ye et al., 2000). This rice variety is now being cross

20、ed into adapted varieties, with field tests possible in a year or two. Grape vines are susceptible to several diseases that reduce the amount and the quality of wine grapes and table grapes or even kill the vine. Genes that confer resistance to particular diseases would reduce the cost of battling d

21、iseases in the vineyard. Researchers at the University of Florida have patented a method for producing grape vines that carry a silkworm gene to provide protection from Pierces disease, a fatal bacterial disease that affects grapes and several other plants.51Improved nutritional content and delayed

22、ripening are transgenic traits of interest in tomatoes. Source: USDA Canola is a major oilseed crop. Transgenic research has focused on improving the nutritional quality of canola oil by enhancing the Vitamin E content or by modifying the balance of fatty acids. Nicotine-free tobacco is now being gr

23、own for a projected introduction of nicotine-free cigarettes52Decaffeinated coffee is now made by treating coffee beans to remove the caffeine. Other methods are criticized for removing some of the desirable, flavor-producing components along with the undesirable caffeine. Papaya is a tropical fruit

24、 rich in Vitamins A and C, but susceptible to a number of serious pests and diseases. The transgenic variety UH Rainbow, resistant to the papaya ringspot virus, is currently in production in Hawaii. 53Food crops engineered to produce edible vaccines against infectious diseases would make vaccination

25、 more readily available to children around the world. White mold (Sclerotinia) is a serious problem for sunflower producers in some areas. Resistance to this disease would expand the area in which sunflowers can be grown and might improve yields in areas of current cultivation. 54Transgenic mice,10

26、weeks, 44g and 29gTransgenic mice,10 weeks, 44g and 29g转基因动物转基因动物55l人胰岛素人胰岛素: 从猪和牛的胰脏提取，获得从猪和牛的胰脏提取，获得100g胰岛素需胰岛素需800-1000kg的牛胰脏。的牛胰脏。现在用基因工程方法在大肠杆菌中表达产生现在用基因工程方法在大肠杆菌中表达产生l人生长激素人生长激素: 具有物种特异性，只能用人的生长激素来治疗侏儒症。以前从具有物种特异性，只能用人的生长激素来治疗侏儒症。以前从尸体脑垂体中提取，来源非常有限，现在用基因工程方法在大肠杆菌中表尸体脑垂体中提取，来源非常有限，现在用基因工程方法在大肠杆

27、菌中表达产生达产生l干扰素干扰素: 体外培养人体细胞来生产，产量低，成本高，现用重组大肠杆菌生体外培养人体细胞来生产，产量低，成本高，现用重组大肠杆菌生产产在医学中的应用在医学中的应用5657基因工程用于疫苗生产基因工程用于疫苗生产l常用的制备疫苗的方法，一种是弱毒活疫苗，一种是死疫苗。两种疫苗各有自身的常用的制备疫苗的方法，一种是弱毒活疫苗，一种是死疫苗。两种疫苗各有自身的弱点。活疫苗隐含着感染的危险性。死疫苗免疫活性不高，需加大注射量或多次接弱点。活疫苗隐含着感染的危险性。死疫苗免疫活性不高，需加大注射量或多次接种种l利用基因工程制备重组亚基疫苗，可以克服上述缺点，亚基疫苗指只含有病原物的利用基因工程制备重组亚基疫苗，可以克服上述缺点，亚基疫苗指只含有病原物的一个或几个抗原成分，不含病原物遗传信息。重组亚基疫苗就是用基因工程方法，一个或几个抗原成分，不含病原物遗传信息。重组亚基疫苗就是用基因