核酸分子杂交_(1) - 副本

1、1分子生物学分子生物学 Molecular Biology核酸的分子杂交核酸的分子杂交Nucleic Acid HybridizationDepartment of biochemistry and molecular biology2Content of Table一、一、核酸的检测核酸的检测二、二、核酸分子杂交技术的原理核酸分子杂交技术的原理三、三、核酸探针的制备核酸探针的制备四、核酸探针的标记四、核酸探针的标记五、核酸分子杂交技术五、核酸分子杂交技术3一、核酸的检测一、核酸的检测n包括包括DNA的质量、大小、纯度检测的质量、大小、纯度检测4 凝胶电泳技术凝胶电泳技术n样品的物理性质样品的

2、物理性质 分子大小、电荷、空间构型分子大小、电荷、空间构型n支持物介质支持物介质 琼脂糖，琼脂糖，100-60000bp, 聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺，1-500bpn电场强度，电场强度，5V/cmn缓冲液离子强度缓冲液离子强度 TAE, TBE, TPE 5操作过程6DNA分子大小的检测分子大小的检测NEB，1Kb DNA Ladder：3kb=62.5ng， 1kb=21.0ngPCR产物3Kb1Kb7一、核酸分子杂交技术的一、核酸分子杂交技术的原理原理 有有互补特定核苷酸序列的单链互补特定核苷酸序列的单链DNA或或RNA混在混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。一起时，其相应同源区

3、段将会退火形成双链结构。 如把一段已知基因（如把一段已知基因（DNA或或RNA）的核酸序列）的核酸序列用合适的标记物（如放射性同位素、生物素等）予用合适的标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作以标记，当作探针（探针（probe), 与变性后的单链基因组与变性后的单链基因组DNA或或RNA等进行杂交。等进行杂交。 用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把技术）把标记物标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列检测出来，就可确定靶核苷酸序列的拷贝数及表达丰度等。的拷贝数及表达丰度等。 8910nDNADNA变性变性是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，

4、双链变成单链，从而使核酸的天然构象和性质发生改变。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。n凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。 11n溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后代之以柔软而松散的无规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降。n溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变，使DNA溶液的旋光性发生变化。n 增色效应。指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱

5、基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。 12n复性指变性DNA 在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为 退火(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成。DNA的复性不仅受温度影响,还受DNA自身特性等其它因素的影响。 13 应应 用：用：1）检测特定生物有机体之间是否存在）检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；亲缘关系；2）用来揭示核酸片段中某一特定基因）用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。的存在与否、拷贝数及表达丰度。 14二、核酸探针

6、的制备二、核酸探针的制备探针探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的一段带有检测标记的与目的基因或目的基因或目的DNA特异互补的已知特异互补的已知核苷酸序列。核苷酸序列。15理想的探针理想的探针1.要加以标记、带有示踪物要加以标记、带有示踪物，便于杂交后检测和鉴，便于杂交后检测和鉴定杂交分子。定杂交分子。2.应是单链应是单链，若为双链用前需要先行变性为单链。，若为双链用前需要先行变性为单链。3.具有高度特异性具有高度特异性，只与靶核酸序列杂交，不与样，只与靶核酸序列杂交，不与样本中存在的其它核酸杂交。本中存在的其它核酸杂交。4.探针探针长度一般是十几个碱基不等长度一般是十几个碱基不等，小

7、片段探针较，小片段探针较大片段探针杂交速率快。大片段探针杂交速率快。5.作为探针的核苷酸序列要作为探针的核苷酸序列要选取基因编码序列选取基因编码序列，避，避免用内含子及其它非编码序列。免用内含子及其它非编码序列。6.标记的探针应具有标记的探针应具有高灵敏度、稳定，标记方法简高灵敏度、稳定，标记方法简便、安全。便、安全。16(一）探针的一）探针的分类分类据制备方法及核酸性质不同，可分为：据制备方法及核酸性质不同，可分为： 基因组基因组DNA探针（探针（genomic probe） cDNA探针（探针（cDNA probe） RNA探针（探针（RNA probe） 寡核苷酸探针（寡核苷酸探针（ol

8、igonucleotide probe)据探针标记物的类型不同：据探针标记物的类型不同：同位素标记的探针同位素标记的探针非同位素标记的探针非同位素标记的探针17 cDNA（complementary DNA）是指互补）是指互补于于mRNA的的DNA分子。分子。 这种这种DNA探针不含有内含子序列。因此探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。尤其适用于基因表达的检测。2、 cDNA probe18 采用基因克隆或体外转录的方法获采用基因克隆或体外转录的方法获得。有些病毒的基因组是得。有些病毒的基因组是RNA，分离后，分离后经适当标记可制成经适当标记可制成RNA探针探针。3、 RNA

9、probe19三、核酸探针的标记三、核酸探针的标记 为确定探针是否与相应基因组为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。以便在结合部位获得可识别的信号。20 21核酸分子杂交信号的核酸分子杂交信号的检测检测n放射性同位素标记探针：放射性同位素标记探针： 放射自显影放射自显影。 n非放射性同位素标记探针：非放射性同位素标记探针： 偶联反应偶联反应+显色反应显色反应。22四、核酸分子杂交技术四、核酸分子杂交技术 核酸分子杂交核酸分子杂交 固相杂交固相杂交 液相杂交液相杂交 印迹杂交印迹杂交 原位杂交原位杂交n固相杂交：固

10、相杂交：结合于某种固相支持物上的待结合于某种固相支持物上的待测样品与溶解于杂交液中的探针进行的杂测样品与溶解于杂交液中的探针进行的杂交。包括膜上印迹杂交、原位杂交。交。包括膜上印迹杂交、原位杂交。n液相杂交液相杂交：待测样品和探针均溶于液体中待测样品和探针均溶于液体中进行杂交反应。进行杂交反应。23 此技术由此技术由Southern 1975年首先设计。年首先设计。被被检测对象为检测对象为DNA。 （一）（一）Southern 印迹杂交印迹杂交2425带有带有DNA片段的凝胶片段的凝胶DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸至膜（尼龙膜或硝酸

11、纤维素滤膜）上纤维素滤膜）上转膜转膜杂交、显影杂交、显影凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液转移用缓冲液转移DNADNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜Southern Southern 印迹杂交的技术流程印迹杂交的技术流程2627Northern blot28 5、Southern杂交杂交 、预杂交、预杂交：封闭膜上能与：封闭膜上能与DNA结合的位点结合的位点 预杂交液为不含预杂交液为不含DNA探针的杂交液。探针的杂交液。 、杂交、杂交：液相中的：液相中的DNA探针与膜上的待测探针与膜上的待测DNA 杂交，双链杂交，双链DNA探针需加热变性为单探针需加热变性为单 链，再杂交。链，再杂交。 、洗膜、洗膜

12、：去除游离的放射性探针或非特异结合：去除游离的放射性探针或非特异结合 的的 DNA。31.（20分）分）图图1是一个常染色体遗传病的家系系谱。致病基因（是一个常染色体遗传病的家系系谱。致病基因（a）是由正常）是由正常基因（基因（A）序列中一个碱基对的替换而形成的。图）序列中一个碱基对的替换而形成的。图2显示的是显示的是A和和a基因区域中某限制酶的酶切位点。、分别提取家系中基因区域中某限制酶的酶切位点。、分别提取家系中1、2和和1的的DNA，经过酶切、电泳等步骤，再用特异性探针做分子杂交，结，经过酶切、电泳等步骤，再用特异性探针做分子杂交，结果见图果见图3。（1）2的基因型是的基因型是_。（2）

13、一个处于平衡状态的群体中）一个处于平衡状态的群体中a基因的频率为基因的频率为q。如果。如果2与一与一个正常男性随机婚配，他们第一个孩子患病的概率为个正常男性随机婚配，他们第一个孩子患病的概率为_。如果第一个孩子是患者，他们第二个孩子正常的概率为如果第一个孩子是患者，他们第二个孩子正常的概率为_。（3）研究表明，世界不同地区的群体之间，杂合子（）研究表明，世界不同地区的群体之间，杂合子（Aa）的频）的频率存在着明显的差异。请简要解释这种现象。率存在着明显的差异。请简要解释这种现象。_；_。（4）B和和b是一对等位基因。为了研究是一对等位基因。为了研究A、a与与B、b的位置关系，的位置关系，遗传学

14、家对若干基因型为遗传学家对若干基因型为AaBb和和AABB个体婚配的众多后代的基因个体婚配的众多后代的基因型进行了分析。结果发现这些后代的基因型只有型进行了分析。结果发现这些后代的基因型只有AaBB和和AABb两种两种。据此，可以判断这两对基因位于。据此，可以判断这两对基因位于_染色体上，理由是染色体上，理由是_。（5）基因工程中限制酶的作用是识别双链）基因工程中限制酶的作用是识别双链DNA分子的分子的_，并切割，并切割DNA双链。双链。（6）根据图）根据图2和图和图3，可以判断分子杂交所用探针与，可以判断分子杂交所用探针与A基因结合的基因结合的位置位于位置位于_。)1 (3qq43【答案】（

15、【答案】（1）AA或或Aa（2） （3）不同地区基因突变频率因环境的差异而不同）不同地区基因突变频率因环境的差异而不同 不同的环境不同的环境条件下，选择作用会有所不同条件下，选择作用会有所不同（4）同源）同源 基因基因AaBb个体只产生个体只产生Ab、aB两种类型配子，不符合两种类型配子，不符合自由组合定律自由组合定律（5）特定核苷酸序列）特定核苷酸序列 （6）酶切位点与之间）酶切位点与之间32（四）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交（四）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交Dot blotting and slot blotting原理：原理：是将被检标本的是将被检标本的RNA或或DNA变性后直接点样变性后直

16、接点样吸附于硝酸纤维膜上，然后用标记探针与之杂交。吸附于硝酸纤维膜上，然后用标记探针与之杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。时检测多个样品。 优点：优点：用于基因组中特定基因及其表达的定性及定用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简便、快速、灵敏、样品用量少。量分析，方法简便、快速、灵敏、样品用量少。缺点：缺点：不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。有一定比例的假阳性。333435菌落原位杂交菌落原位杂交 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出菌落裂菌以释出DNA。将。将DNA烘干固定于烘干固定于膜上与膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。位。3637菌落原位杂交n下图为通过DNA分子杂交鉴定含有某特定DNA的细菌克隆示意图。下列叙述正确的是A根据培养皿中菌落数可以准确计算样品中含有的活菌实际数目B外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制C重组质粒与探针