任务单元抗原抗体的制备ppt课件

1、1.掌握抗血清的制备过程及鉴定方法，正确断定抗血清的质量，能正确处置抗血清制备中的干扰要素。2.掌握单克隆抗体技术的原理、制备流程和运用。3.正确了解多克隆抗体、单克隆抗体和佐剂的概念。4.知晓免疫原的制备方法及意义。5.了解基因工程抗体的优点、种类和运用。抗原免疫原：免疫原immunogen)指用于制备抗体的抗原(antigen)或半抗原(hapten。抗原颗粒性抗原可溶性抗原蛋白质抗原多糖抗原核酸抗原颗粒性抗原细胞性抗原：血细胞和组织细胞病原体：细菌、病毒、支原体、寄生虫等采集静脉血玻璃珠脱纤维离心、洗涤调适宜浓度用途:(1)作为诊断菌液。(2)用于制备免疫血清或诊断血清。培育细菌分别、鉴

2、定扩展培育适宜浓度灭活处置离心、洗涤1.普通性状检定 菌种典型；抗原为乳白色悬液；盐水中不自凝。 2.无菌实验 甲醛处置后37培育2-3d无菌生长3.纯度检查 革兰氏染色镜检10个视野无杂菌。4.特异性实验 玻片凝集实验强阳性。5.定量凝集实验 凝集效价不低于原血清凝集效价的50%6.浓度测定。组织细胞粗抗原制备组织细胞粗抗原制备-组织、细胞清洗和去污处置组织、细胞清洗和去污处置细胞裂解捣碎方法匀浆物提取初筛物可溶性抗原制备可溶性抗原制备-匀浆物中目的抗原提取纯化匀浆物中目的抗原提取纯化不同纯化方法，多次纯化不同纯化方法，多次纯化鉴定定性、定量、特异性、理化性等分装、保管可溶性抗原制备的普通流

3、程可溶性抗原制备的普通流程一资料的选取与预处置二细胞裂解三纯化抗原的提取四抗原的鉴定五抗原的浓缩与保管五步骤组织：新颖或低温保管-40处置方法：1器官或组织剪去包膜、结缔组织及大血管，生理盐水或缓冲液洗去残留血液和污物，剪成小块，再捣碎。2细胞 缓冲液混悬后离心，再进展裂解或捣碎。1.细胞匀浆1高速组织匀浆器法2研磨法：玻璃匀浆器适用范围：组织细胞和微生物细胞。机制：能够与强声波作用于溶液时，气泡产生、长大和破碎的空化景象有关，空化景象引起的冲击波和剪刀力使细胞裂解。超声破碎的效率取决于声频、声能、处置时间、细胞浓度和细胞的类型。特别留意：运用时留意降温、防止过热，防止产生气泡。适用范围：多种

4、微生物细胞机制：利用酶反响，破会细胞壁上特殊的键，从而到达破坏细胞壁的目的。优缺陷：优点：专注性强，酶解条件温暖。 缺陷：费用较高。运用做多的是：溶菌酶专注分解细胞壁上糖蛋白分子的-1，4-糖苷键。适用范围：培育细胞、细胞壁较脆弱的菌体机制：忽然冷冻时细胞内冰晶的构成及胞内外溶剂浓度的忽然改动而破坏细胞。优缺陷：优点：简便 缺陷：破碎率低 引起对冻融敏感的蛋白量变性适用范围： 细菌和培育细胞机制：适当条件下温度、pH、低离子强度，外表离子活性剂与脂蛋白构成微泡，使细胞膜通透性改动。优点：作用温暖最常用的是：SDS，Tween1.蛋白质抗原的纯化纯化方法：1超速离心法分别亚细胞成分和大分子蛋白质

5、2选择性沉淀法盐析法最为经典3凝胶过滤法4离子交换层析法5亲和层析法原理原理: :利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒有不同沉降速度的颗粒, ,处于不同密度的梯度层内处于不同密度的梯度层内，到达彼此分别的目的。，到达彼此分别的目的。特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗原，极特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗原，极难将某一抗原成分分别出来。难将某一抗原成分分别出来。运用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗原运用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗原物质的分别，如物质的分别，如IgMIgM、C1qC1q、甲状腺球蛋白、载脂蛋、甲

6、状腺球蛋白、载脂蛋白白A A、B B等。等。原理：根据各蛋白质理化特性的差别，采用各种沉淀原理：根据各蛋白质理化特性的差别，采用各种沉淀剂或改动某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而到剂或改动某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而到达纯化的目的。达纯化的目的。常用方法：盐析沉淀法不同盐浓度那么溶解度不同常用方法：盐析沉淀法不同盐浓度那么溶解度不同；常用；常用33335050饱和度的硫酸铵。饱和度的硫酸铵。特点：简一方便，纯度不高，粗提球蛋白。特点：简一方便，纯度不高，粗提球蛋白。运用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。运用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。原理：凝胶具有三维空间多孔网状构造的物质

7、，原理：凝胶具有三维空间多孔网状构造的物质， 经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种 分分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分 子物子物质不能进入凝胶颗粒的网孔构造内，在凝质不能进入凝胶颗粒的网孔构造内，在凝 胶颗粒胶颗粒之间的空隙中很快地经过凝胶床，短时之间的空隙中很快地经过凝胶床，短时 间内被洗间内被洗脱出来；而分子较小的物质那么进入凝脱出来；而分子较小的物质那么进入凝 胶网孔构胶网孔构造内，反复遭到阻滞，洗脱较慢。分造内，反复遭到阻滞，洗脱较慢。分 成大、中、成大、中、小三种类型。小三种类型。原理：利用带离

8、子基团的纤维素或凝胶，吸附交换原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的才干有差别。同，所带电荷不同，与纤维素结合的才干有差别。当梯度洗脱时，逐渐添加流动相的离子强度，使参当梯度洗脱时，逐渐添加流动相的离子强度，使参与的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位与的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位 置，从而置，从而使血清中的蛋白质分成使血清中的蛋白质分成球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，到达分别蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，到达分别纯化的目

9、的。纯化的目的。原理：根据抗原抗体的生物学活性进展分别和提纯原理：根据抗原抗体的生物学活性进展分别和提纯的技术。将纯化的抗的技术。将纯化的抗IgGIgG附着于惰性的固相基质上，附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分别制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分别的的IgGIgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体( (抗抗IgG)IgG)结合；当改动洗脱条件可重新解离，将待分别结合；当改动洗脱条件可重新解离，将待分别的的Ig Ig洗脱下来，到达纯化的目的。洗脱下来，到达纯化的目的。优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。优点：提取纯度高

10、、抗原抗体不失活性。主要步骤破碎细胞蛋白质的去除核酸的沉淀酚和氯仿乙醇核酸的保管1温度 -70 长期保管 -20 45最正确和最简单2介质 TE缓冲液最常用1非共价键解离法 肽链亚单位之间以氢键、静电引力等非共价键结合，这些键结合力较弱，可经2种方法将其断开制备片段。 改动pH：蛋白质解离的临界值为pH 34(羧基滴定范围)和pH 910(赖氨酸酪氨酸滴定范围)，当参与酸或碱使pH低于，3或高于10时，肽链亚单位就会解离； 利用强变性剂：多数蛋白在8molL脲或6moI儿盐酸胍中会发生变性，使肽链亚单位解离，此法也可用于载脂蛋白抗原的解离和胶原肽的提取。2共价键解离法 二硫键是衔接免疫球蛋白肽

11、链的共价键，解离二硫键可将轻链与重链分开。解离的方法多采用氧化法和复原法。氧化法的优点是切开二硫键后，肽链不能重新构成二硫键，便于肽链纯化，缺陷是蛋氨酸(甲硫氨酸)被氧化成亚砜，色氨酸侧链被破坏。 复原法目前常用，其原理是将二硫键复原成巯基，但复原的琉基极不稳定，易再重新结合成二硫键，必需及时用碘乙酸或碘代乙酰胺进展羧甲基化以封锁巯基。3酶解法 酶解法的专注性极好，不同的片段可用不同的酶进展裂解。如木瓜酶水解IgG可获得1个Fc段和2个Fab段；胃蛋白酶水解IgG可获得F(ab)：和数个小片段。用木瓜酶水解得到的Fc段常作为抗原来制备抗重链血清，胃蛋白酶水解得到的F(ab)；常作为抗体试剂运用

12、。1.定量测定 生化技术 如 UV法、双缩脲、酚试剂等蛋白检测方法。常用的是紫外光吸收法，该法测定280nm和260nm的吸光度(A)值，并根据公式计算蛋白含量。蛋白含量(mgm1)A280nm1.45-A260nm0.742.纯度鉴定 PAGE、免疫电泳、双扩3.免疫活性鉴定 免疫电泳、双向免疫分散法、ELISA4.浓缩与保管半抗原：仅有抗原性的物质。半抗原+载体=完全抗原一载体 1.蛋白质 是构造复杂的大分子胶体物质，是一种良好的载体，常用的有牛血洁白蛋白、人血洁白蛋白、牛甲状腺球蛋白和血蓝蛋白等。其中牛血洁白蛋白溶解度较高、免疫原性强且易获得，因此最为常用。蛋白质与半抗原的结合主要经过游

13、离氨基、游离羧基、酚基、巯基、咪唑基、吲哚基和胍基等活性基团的缩合。 2.多肽聚合物 人工合成的载体。常用多聚赖氨酸(polylysine)，其分子量高达lOOkD以上，是良好的载体。这种多肽聚合物与半抗原结合后，可诱导产生高效价、高亲合力的抗体。 3.大分子聚合物 羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidonc，PVP)等大分子聚合物均可与半抗原结合，参与弗氏完全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。二半抗原与载体的衔接方法 1.物理法 经过吸附作用。 2.化学法 经过交联实现。三半抗原的鉴定 1.目的：测定半抗原与载体

14、的比例。 2.测定方法： 1吸收光谱分析法 2放射性核素标志半抗原掺入法1假设半抗原有适宜的吸收光谱，测定在一定波长下复合抗原和载体之间克分子吸光度的差别，然后把这个差别与同样波长下半抗原的克分子吸光度数相比较，就可以准确地计算出所结合的半抗原分子数。2在偶联反响液中参与一定量的放射性核素标志的半抗原，偶联反响后经充分透析，丈量透析袋中的放射性含量，计算结合到载体上的半抗原分子数。免疫佐剂佐剂：先于抗原或与抗原同时注入体内，可加强机体对该抗原的特异性免疫应对或改动免疫应对类型的物质被称为免疫佐剂，简称佐剂。本质：佐剂可视为一种非特异性免疫加强剂，可加强体液免疫和细胞免疫应对。1.种类具备免疫原

15、性的佐剂：如卡介苗、枯草分枝具备免疫原性的佐剂：如卡介苗、枯草分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、脂多糖、杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、脂多糖、细胞因子等。细胞因子等。 不具备免疫原性的佐剂：如氢氧化铝佐剂、不具备免疫原性的佐剂：如氢氧化铝佐剂、磷酸铝、磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、外表活磷酸铝、磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、外表活性剂、藻酸钙、多聚核苷酸、胞壁肽等。性剂、藻酸钙、多聚核苷酸、胞壁肽等。 运用最多的是福氏佐剂、细胞因子佐剂。运用最多的是福氏佐剂、细胞因子佐剂。 1福氏佐剂：分完全福氏佐剂石蜡油+羊毛脂+卡介苗、不完全福氏佐剂石蜡油+羊毛脂两种。福氏完全佐剂可提高佐剂效能，但注射后易产生部分耐久性溃疡和肉芽肿，宜留意。 2细胞因子佐剂：细胞因子佐剂与抗原合用，可有效激发机体的免疫功能。IL-2、IL-1、IFN、IL-12、GM-CSF皆较常运用；细胞因子佐剂还被广泛运用于肿瘤基因治疗中。用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、poly poly ICIC、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白白常用于动物实验的佐剂：弗氏佐