增温和不同土壤对夏蜡梅幼苗生长及生理的影响

1、西 南 大 学硕士学位论文选题报告学 号 112009317001699姓 名 徐兴利 培养类别 全日制研究生 学科专业 生态学 研究方向 植物生态学 培养单位 西南大学 指导教师 金则新教授 2010年11月06日增温和不同土壤对夏蜡梅(Sinocalycanthus chinensis)幼苗生长及生理的影响1 国内外研究现状1.1 夏蜡梅概况夏蜡梅（Sinocalycanthus chinensis）为蜡梅科(Calycanthaceae)夏蜡梅属（Sinocalycanthus）的落叶灌木，高23m；花口径4.57cm；外轮花被片1014，白色，边缘淡紫红色，内轮花被片716，肉质；雄蕊

2、1619；心皮1112；聚合果托钟形或近顶端微收缩；瘦果褐色，长1.21.5cm；花期为5月中下旬，果期10月（章绍尧和丁炳扬, 1993）。夏蜡梅群落分布区主要位于海拔5501200米中山地带的山坡或溪谷林下。分布区属于亚热带季风气候，气候温和，年平均气温1216，极端最低气温不低于-13，极端最高气温约42，年降水量约14001600mm；相对湿度不低于80%。群落土壤是由花岗岩发育而成的山地黄壤，土层深厚，疏松湿润，富含有机质，pH值4.65.5（徐耀良等, 1997）。夏蜡梅为较耐荫树种，荫蔽湿润且土壤稍酸性的环境下生长较好，不耐强光和干旱，主要集中生长在溪沟两旁的沟谷地段和常绿阔叶林

3、下，成为常绿阔叶林下木层的优势种以及次生灌丛的主要建群种（张方钢等，2001）。夏蜡梅作为第三纪孑遗物种，现资源极少，目前主要分布于浙江临安市西部狭小的范围内、天台县大雷山和安徽绩溪龙须山，已列为国家二级重点保护植物。其花朵美丽、观赏价值高；其叶对感冒、咳嗽、气喘等具有一定的疗效；并且分类地位独特，具有重要的植物系统学研究价值。1.2 夏蜡梅的研究进展夏蜡梅自60年代在临安被发现以来，受到众多研究工作者的广泛关注。前期的研究主要局限于孢粉学（李林初, 1990）、细胞学（李林初, 1986; 黄坚钦, 1998）、分类学、系统与进化（李林初, 1988; 1989; 张若惠和沈湘林,1999）

4、以及种群与群落学（张方钢等, 2001）等方面，近几年开展了较多栽培繁殖方面的研究（陈辉, 1992; 兰伟, 2001），同时在生理生态特性（柯世省和金则新, 2007; 2008; 马金娥, 2007b）、繁育系统（张文标, 2007）、次生代谢（金则新等, 2006a; 2006b; 2007a; 李钧敏等, 2006; 2007; 马金娥等, 2007a）、种子特性（蔡琰林, 2008）和遗传多样性（谈探等, 2008; 张文标等, 2007; 金则新和李钧敏, 2007; Li Jin, 2006）以及分子系统地理学（谈探, 2008）等方面进行了深入研究，并取得了巨大进展。野外资源

5、调查显示，生境片断化使夏蜡梅局限于互不相连的小区域内，被分隔成若干个呈岛状分布的小居群，并且不同居群间有不同距离的间隔（张方钢等, 2001）；现野生资源不多，除了已发现的临安和天台分布地外，2007年陈香波等（2008）在安徽绩溪县龙须山新发现了一个夏蜡梅自然分布居群，植株共约3000株，使夏蜡梅分布地从原有2个扩展到了3个。对临安和天台居群的遗传多样性研究表明，夏蜡梅不同居群间出现了遗传分化，其中，天台大雷山居群与临安各居群之间（>200 km）存在显著性的遗传地理隔离，但安徽居群的遗传特征如何，与天台和临安分布地的遗传分化以及遗传隔离情况如何，目前尚未报道。以往的研究表明，浙江境内

6、的夏蜡梅居群除了在遗传上出现分化外，对不同居群的夏蜡梅的黄酮、总酚、绿原酸、游离蒽醌等次生代谢产物进行分析也发现，各居群间的次生代谢产物含量存在差异，有些居群之间甚至存在极显著差异（金则新等, 2006a; 2006b; 2007; 李钧敏等, 2006; 2007; 马金娥等, 2007）；对大明山和大雷山夏蜡梅果实以及种子形态研究也得到了相似的结果居群间出现一定程度的表型分化（蔡琰林, 2008）。而花、果实和种子等繁殖器官在3个夏蜡梅分布地内和分布地间是否存在变异未见报道。夏蜡梅总生物碱、总酚以及总皂甙等次生代谢产物与环境因子的相关性研究表明，部分次生代谢产物含量与环境因子间存在一定的相

7、关性（金则新等, 2006a；李钧敏, 2006）；张文标和金则新（2007）对不同生境夏蜡梅居群的果实、种子形态变异及其与环境因子相关性进行了研究，得出果实和种子表型性状在居群间和居群内都存在一定程度的变异，且以灌丛生境的性状最优，果实和种子形态与光照条件的相关性最大，与土壤因子的相关性较小；而夏蜡梅表现型的变异与遗传变异之间的相关性如何，也需要进一步深入研究。1.3 增温对植物的影响研究进展温度升高会对植物的光合作用产生影响，温度对于植物光合作用的影响有两种情况：1）环境温度高于植物光合的最适温度时，植物的光合速率降低。其原因可能是与O2相比温度升高时，相对减少了CO2的溶解度和Rubis

8、co对CO2的亲和性。2）环境温度低于植物光合的最适温度时，温度增加与CO2浓度升高对植物光合速率的影响表现为协同作用，即温度增加时植物的光合速率加快。这可能是由于光合作用属酶促反应，光合速率会随温度的上升而增加。Tissue等（1997）发现，火炬松（Pinus taeda）的光合作用与温度的增长存在正相关关系。Hamerlynck等（2000）发现沙漠多年生灌木Larrea tridentate在9d高温处理中，用700molmol-1CO2进行熏蒸，可增大光合速率。同时也有研究表明，在光强、二氧化碳浓度相同时，温度对光合作用的影响很大。在光合作用正常进行的温度范围内（1035），光强、C

9、O2充足时，温度高，则光合强。在光强度高时，对光合作用影响最大的一个因素就是温度，应适当提高温度，以提高光合速率。对高温胁迫下植物光合色素含量的变化研究不多。郭培国等(1998)对此进行了研究结果表明，在5 d 高温(40 )胁迫下 ,多数水稻材料的叶绿素含量均表现出下降的趋势 ,但一种杂交水稻母本的叶绿素含量没有表现出下降的趋势，这可能与栽培稻的长期驯化有关。1.4 植物物候对温度升高的响应研究进展过去一个多世纪，全球平均温度已经增加了0.6(±0.2)。 根据IPCC预测，到本世纪末，全球表面温度可能会增加1.84.0，而高纬度或高海拔地区对温度升高的响应可能会更为敏感而迅速。温

10、度控制生态系统中许多生物和化学反应速率，且几乎影响着所有生物学过程，植物物候也不例外。 温度的升高直接影响着植物的物候。在温度升高条件下，植物春季芽的展开提前，花期提前，秋季植物芽的休眠推后或无影响。增温对植物物候影响可能因物种和处理时间(短期/长期)而异。Henry和Molau使用国际冻原计划(ITEX)研究方法，利用开顶式同化箱控制环境温度，研究增温对高寒植物物候的影响，结果发现物种的物候期发生了显著变化，但植物物候对增温的短期反应只是个体特征，不能反映一般性的格局和强度。 Dunne等利用辐射加热器控制环境温度研究气候变化对11种亚高山灌丛和草本花期的可能影响，结果表明各物种花期对增温的

11、反应有所不同，他们认为花期对全球变暖的这种短期响应可能导致种间关系发生变化。 Suzuki和Kudo利用开顶式同化箱法控制环境温度研究日本北部Taisetsu山脉高山极地植物物候对模拟增温的响应，结果表明实验初期各观测物种的生长季延长、落叶期滞后；在实验进行到第3个生长季时，只有笃斯越橘(Vaccinium uliginosum)提前发芽，而叶杜香(Ledum palustre)、北极果(Arctous alpinus)和岩高兰(Empetrum nigrum)表现不明显。植物物候对温度升高的响应方式可能在不同功能群间存在一定的差异。Billings认为温度升高对不同物种的影响不同，但对同一功

12、能群影响可能是相似的，因为同一功能群其生理特性、生殖结构和叶形态特征都相对一致。Chapin等将极地及高山物种分为木本(落叶型和常绿型)和草本(禾本类、非禾本类和莎草类)。Arft等通过meta-analysis方法对国际冻原计划(ITEX)13个站点短期(14 a)主要物候现象(展叶、始花和休眠)观测结果进行综合定量分析，结果表明，展叶对模拟增温的响应在不同功能群间存在显著的差异，而花期和休眠的差异性较小。同样，Henry和Molau通过对国际冻原计划(ITEX)6个站点研究结果进行归纳，发现不同功能群物候对温度升高的响应存在明显的差异，响应的敏感程度依次为非禾本草本类>禾本类>

13、落叶型灌丛>常绿型灌丛。植物物候对模拟增温的响应是否存在区域间的差异？Arft等对国际冻原计划(ITEX)13个站点短期研究结果统计分析表明，展叶和始花在区域间没有明显的差异，但秋季叶的枯萎则表现出显著差异(温度升高使高山植物枯萎期推迟，而对极地物种枯萎时间影响并不显著)。 同样，Henry和Molau认为除了个别物种，植物物候对模拟增温响应的方式和强度在6个国际冻原计划(ITEX)站点间胡研究结果都是相似的。2 研究目的和意义温度几乎影响所有的生物学过程，特别是光合作用和呼吸作用酶活性，以及 CO2 和 O2 在细胞中的溶解度等，环境温度升高可能对植物光合作用和呼吸作用产生直接显著影响

14、。由于研究方法不同，实验植物种类和生态型对温度的敏感性及其光合作用的最适温度存在差异，温度升高通常使植物的呼吸速率加快、叶片气孔导度升高，而对植物光合作用却表现出增加、下降或无影响。以全球变暖和大气CO2浓度升高为主要特征的全球变化正在改变着陆地生态系统的结构和功能，威胁着人类的生存与健康，因而倍受世界各国政府和科学家的普遍关注。大量监测和模型模拟研究表明，由上个世纪开始的全球温室效应在新的世纪正在继续和扩大。 政府间气候变化专门委员会(IPCC)第4次评估报告预测，从现在开始到2100年，全球平均气温将升高1.84.0目前全球气候变化已经成为不容置疑的事实。植物物候节律与气候等环境因子密切相

15、关，全球气候变化势必对植物物候产生深刻的影响，因此关于物候对气候变化响应的研究正成为一个新的热点领域。 基于地面观测、遥感监测和物候模型等研究表明，过去百余年的气候变化已经对植物物候产生了显著的影响。虽然植物物候对全球气候变化的响应因物种及区域而异，但在大尺度上存在共性，如春季物候提前、秋季物候延迟和生长季延伸。本研究拟解决的问题：1）模拟升温对夏蜡梅种子萌发、幼苗存活和生长的影响。2）不同土壤对夏蜡梅种子萌发和幼苗生长的影响。3）二年生夏蜡梅幼苗物候对模拟增温的响应。3 研究特色及创新之处4研究内容：4.1升温对种子萌发、幼苗存活和生长的影响从浙江天台大雷山（DLS）夏蜡梅群落中采集表层土壤

16、300公斤（具体土样由实际花盆决定），然后装入花盆中以备实验需要。种子萌发用小花盆（10厘米直径、10厘米高），幼苗存活和生长用中等大小花盆（20厘米高，15厘米直径）。种子萌发设置3个重复，每个重复50粒种子，持续观察一个月，记录出苗情况。幼苗存活至少用5个重复、幼苗生长用10个重复，每个花盆用一株幼苗。所有幼苗由种子萌发获得。设置三种升温方式：白天升温（早上6点-晚上6点）、晚上升温（晚上6点-早上6点）和全天24小时升温。升温幅度为2。将种子萌发、幼苗存活、幼苗生长的花盆分别放在四种温度条件下进行处理，即三种升温和一种对照（不升温）。在2010和2011年的三个季度（春、夏、秋）对幼苗的

17、光合作用各项参数、叶绿素含量和叶绿素荧光等生理指标测定，对叶、根等形态指标和生物量统计。营养物质变化、叶片、根系、生物量、生理变化（光合作用、叶绿素和荧光）等。4.2不同土壤与种子萌发和幼苗生长从浙江天台大雷山（DLS）采集表层土壤，从母树下采集表层土壤100公斤，然后分成两部分（每部分50公斤，具体土样数量取决于实验实际需要的土壤情况），一部分作为对照，一部分用高压灭菌方法（120，每次持续30分钟，连续三次）去掉土壤微生物。另外从浙江天台大雷山（DLS）4个生境（常绿阔叶林、灌丛、竹林和杉木林）采集不同类型的土壤。于2011年3月将灭菌和没灭菌的土壤及不同类型的土壤分别装入花盆（小花盆，1

18、0厘米直径、10厘米高），然后在每个花盆中放入3粒种子，种植50盆，持续观察一个月，记录出苗情况。将灭菌和没灭菌的土壤及不同类型的土壤分别装入花盆（中等花盆，20厘米高，15厘米直径），然后在每个花盆中种植一株幼苗，10个重复，观察幼苗生长情况。实验持续4个月，最后收获，确定生物量。在2010和2011年的三个季度（春、夏、秋）对幼苗的光合作用各项参数、叶绿素含量和叶绿素荧光等生理指标测定，对叶、根等形态指标和生物量统计。营养物质变化、叶片、根系、生物量、生理变化（光合作用、叶绿素和荧光）等。4.3二年生幼苗物候观测2011年对二年生夏蜡梅幼苗各项指标进行物候观测，包括爆芽、展叶和落叶，构型、

19、构件等指标。5研究方案5.1土壤生物及不同类型土壤与种子萌发和幼苗生长1.1土壤采集和灭菌处理：从夏蜡梅天然群落中采集表层土壤（0-40cm）。取部分土壤通过高压灭菌（121，每次持续30分钟，连续三次）方法去掉土壤生物，医用垃圾袋即可作为灭菌袋。另外从浙江天台大雷山（DLS）4个生境（常绿阔叶林、灌丛、竹林和杉木林）采集不同类型的土壤，每种类型土壤分别采集100公斤。1.2种子萌发和出苗：将灭菌和不灭菌的土壤及不同类型土壤分别装入50个花盆（直径10厘米、高10厘米）中，然后在每个花盆中放入3粒种子，每天记录出苗情况，持续记录一个月。在实验结束后，去掉表土，收集花盆中的种子，确定未出苗种子中

20、有多少已经萌发；根据最终数据确定种子萌发率。多数萌发实验在培养箱的培养皿中进行，而本实验在野外进行，用土壤替换了滤纸！需要种子数量：3×50×2=300粒种子。实验期间供给等量水分！播种深度2cm。1.3幼苗生长：将灭菌和不灭菌的土壤及不同类型土壤分别装入花盆（中等花盆，20cm高，15厘米直径），然后在每个花盆中种植一株幼苗。每种土壤种10株幼苗，共需要20株苗。实验大约持续5个月。在实验期间供给等量水分，观察幼苗生长（叶片数量、植株高度）情况，并测定一些生理指标（光合、呼吸、荧光、酶等），实验结束后收获，确定生物量。特别注意：夏蜡梅需要遮阴！5.2升温对种子萌发、幼苗存

21、活和生长的影响升温幅度：2。三种升温方式：白天升温（早上6点-晚上6点）、晚上升温（晚上6点-早上6点）和全天24小时升温。土壤采集：从夏蜡梅天然群落中夏腊梅母树下采集表层土壤（0-40cm）。将种子萌发和出苗、幼苗存活、幼苗生长的花盆分别放在四种温度处理下，即三种升温和一种对照（不升温）。种子萌发和出苗：这部分完全同上面相应实验，50个重复，每个花盆3粒种子。需要种子数量：3×50×4=600粒种子。幼苗存活：将源于“种子萌发实验”的幼苗种植在小花盆中。具体而言，实验开始前将花盆彻底灌水，然后将10个花盆放在一块作为一组，每种温度处理下放置5组（需要50株幼苗）；实验植株

22、被放置在4种温度处理下（共需要200株），实验期间不在加水，以确定升温对土壤蒸发和植物蒸腾的影响。每天记录死亡植株数，直到植株全部死亡为止。幼苗生长：这部分工作完全同上面的相应实验，包括测定的各种指标。5.3幼苗生理指标测定基本形态指标测定 从长叶开始，每月中旬测量一次，每次测15株夏蜡梅幼苗的基本形态指标：株高、基径、叶片数、叶长和叶宽。保证有3个月的数据。所有处理幼苗光合日进程的测定用美国LI-COR公司生产的Li-6400便携式光合作用测定系统，测定前对光合仪进行系统校正，以保证测量值的合理性。选择晴朗天气从6:0018:00每隔2小时进行测定，每种杂交的植物取5-7株，每株取3个叶子进

23、行测量。重复3次，取平均值。每月测定一次。相关参数净光合速率（Pn）、胞间CO2浓度（Ci）、蒸腾速率（E）、气孔阻力（rs）、暗呼吸速率（Rd）、光合有效辐射（Q）、大气温度（Ta）、叶面温度（Tl）、大气相对湿度（RH）、大气CO2浓度（Ca）等有仪器自动读取。水分利用效率=净光合速率/蒸腾速率。同时做光响应和二氧化碳响应。叶绿素荧光参数日变化 每种处理的夏蜡梅取5-7株，每株取3个叶子进行测量。重复3次，取平均值。每月测定一次。用PS30P（美国OPTI-SCIENCES）便携式叶绿素荧光仪测定，在叶片自然生长角度不变的情况下测定叶绿素荧光基本参数：初始荧光(F0)、最大荧光(Fm)和光

24、系统最大荧光量子产量(Fv/Fm)。其中，F0是PS反应中心全部开放时的荧光水平；Fm是PS反应中心全部关闭时的荧光水平；Fv是最大荧光与初始荧光之差，称为可变荧光，Fv=Fm-F0；Fv/Fm是可变荧光与最大荧光之比，被称为PS的光化学效率，它是植物经过充分暗适应的叶片PS最大或潜在的量子效率指标，一般比较恒定，在0.800.85之间。叶绿素含量(崔勤等，2006) 用便携式叶绿素相对含量测定仪测定各处理的叶绿素相对含量(SPAR)，每个处理测定3株，在每株测定的叶片中脉两侧取5个点。15个数据的均值即为叶片相对含量。之后用以下方法测定叶绿素含量： 在每种处理中随机选择幼苗，取无病虫害、无干

25、叶的叶片, 暗处保存。在避光室内, 取出待测样品,剪碎, 混匀。准确称取0.5000g样品于研钵中, 加80%丙酮25ml研磨, 然后将研磨后的样品滤入50ml容量瓶中, 用80%丙酮洗净研钵和滤纸, 洗液并入容量瓶中, 且定容至50ml, 测鲜样叶绿素含量。80%丙酮作参比液, 分别在645nm和663nm处测定样品液的吸光值, 并且按下列公式计算叶绿素含量,重复（每个授粉3株幼苗，每株植物上所有叶子的混合）3 次，取平均数，每月测定一次。CT=Ca+Cb。 (1)Ca=( 12.7 A663- 2.59 A645) *V/m (2)Cb=( 22.9 A645- 4.67 A663) *V

26、/m (3)式中, Ca 为叶绿素a 含量, Cb 为叶绿素b 含量, CT 为总叶绿素含量, V 为提取液体积, m 为样品重。5.4 幼苗酶液提取、酶活力及蛋白质含量的测定酶液提取：取0.5g叶片加入预冷的3ml0.05mol·L-1磷酸缓冲液（内含1mmol·L-1EDTA和1%PVP）研磨至匀浆，4冷冻离心(10000rad/s,30min),上清液即为酶提取液。APX的提取液需在提取液中加1mmol·L-1ASA·SODAPXCAT和GR。SOD活性益抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原50%的酶量为1个活力单位（U），活性用U(mg-1 prote

27、in)表示，APX、CAT和GR活性分别用OD290·min-1·mg-1 protein、OD240·min-1·mg-1 protein和OD340·min-1·mg-1 protein表示。POD测定参照Hammer Schmidt的方法。活性用OD460·min-1·mg-1 protein表示。蛋白质含量的测定：采用考马斯亮蓝法测定。5.5 幼苗形态指标及生物量测定选取不同增温处理及对照组生长状况相似的10株幼苗测以下指标。用直尺测株高( seedling height, SH地上部分）、用游标卡尺测基茎

28、(basal diameter, BSD)、记录叶片数( leaf number, LN )，从盆中取出整株植物，保持根系和叶片完整，小心去掉根上的土，将收获材料洗净并吸干表面水分。测主根长( tap root length, TRL)，用精度为0.0001g的电子天平称量植株鲜重（PFW）、根鲜重（RFW）、茎鲜重（SFW）、叶鲜重（LFW）。 根部形态分析。将样品放置在树脂玻槽内，注水使根部充分散开，再用WinRHIZO根系分析系统分析扫描后完整的根系图像，得到每株总根表面积、总根长、平均根直径和总根体积、根尖数等五个参数。叶片形态分析。将上述扫描根后夏蜡梅的真叶图像分别扫描存入计算机，用

29、WinFOLIA叶片分析系统分析。得到如下参数：每叶真叶面积、真叶周长、真叶长、真叶宽和真叶宽/真叶长。通过计算，既而得到每株幼苗的5个真叶指标：总面积、总周长、总长、总宽和长/宽。之后，将各部分分别于105杀青20min，在75下烘干至恒重，分为茎、叶、主根、侧根，称量各部分干重并计算如下参数：冠部干重（CDW）=茎干重（SDW）+叶干重（LDW）植株干重（PDW）=冠部干重（CDW）+根干重（RDW）根生物量比（RMR）=根干重（RDW）/植株干重（PDW）叶生物量比（LMR）=叶干重（LDW）/植株干重（PDW）茎生物量比（SMR）=茎干重（SDW）/植物干重（PDW）根冠比（R/C）=

30、根干重（RDW）/冠部干重（CDW）主根侧根比(Main root to lateral root ratio， MR /LR)= 主根重/侧根重 比叶面积( specific leaf area, SLA)= 叶片面积/叶片干质量叶面积比率(leaf area ratio，LAR)=植株叶面积/植株干重；比枝长(specific branch length，SBL)=枝长度/枝干重；单位枝长叶数(leaves per branch length，LPBL)=叶片数/枝长度；叶片含水量（LWC，%）(红雨和王林和，2008)=（FW-DW）/DW×100%，其中FW为鲜重；DW为干重 整株干物质积累率=（干总生物量/鲜总生物量）×100%5.6 二年生幼苗物候观测2011年4月，在夏蜡梅芽尚未萌动前，应用随即取样法，在每个植株上选取35个标准枝，用标记卡标记。根据叶的生长特点，不定期记录每个枝条上叶的数量，展叶始末时间，在植物物候活动关