蛋白质测序技术

1、蛋白质测序技术一、蛋白质一级结构的测定 蛋白质的一级结构是蛋白质作用的特异性、空间结构的差异性和生物学功能多样性的基础。 蛋白质的一级结构中除肽键外，有些还含有二硫键。蛋白质一级结构 测定的原理1.氨基酸组成的分析(1) 蛋白质样品的纯化; (2) 蛋白质分子中多肽链数目测定(3) 氨基酸组成的分析蛋白质一级结构的测定测定多肽链的数目蛋白质测序的步骤拆分多肽链拆分多肽链断开多肽链内的二硫键断开多肽链内的二硫键测定每一肽链的氨基酸组成测定每一肽链的氨基酸组成鉴定多肽链的鉴定多肽链的n-末端和末端和c-末端末端裂解多肽链为较小的肽段裂解多肽链为较小的肽段测定各肽段的氨基酸序列测定各肽段的氨基酸序列

2、利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构确定二硫键的位置确定二硫键的位置蛋白质一级结构测定基本原则1.确定蛋白质的纯度在97%以上。2.测定多肽链的数目。3.拆分多肽链。4.分析每一条多肽链的氨基酸组成。5.鉴定多肽链的n末端和c末端氨基酸残基。6.用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段。7.测定各肽段的氨基酸序列。8.拼接各肽段成完整的多肽链。9.确定二硫键的位置。.多肽链数目的测定 根据蛋白质n端和c端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量可确定分子中的多肽链数目。若含一条多肽链，蛋白质的摩尔数与末端基的摩尔数相等；如果后者是前者的倍数，说明该蛋白质分子是由多条多肽链

3、组成。如果检测到的末端基多于一种，表明蛋白质由两条或多条不同的多肽链组成，即样品是杂多聚蛋白质（heteromultimeric protein）。.拆分蛋白质的多肽链 寡聚蛋白质的亚基必须拆分。可用变性剂如8 mol/l尿素、6 mol/l盐酸胍或高浓度盐处理。若亚基间通过二硫桥（s-s）交联，如胰岛素（含两条多肽链）和-胰凝乳蛋白酶（含3条多肽链）则可用氧化剂或还原剂将二硫键断开。 拆开后的单个多肽链可根据它们的大小或/和电荷的不同进行分离、纯化。.拆开多肽链内的二硫桥 多肽链内半胱氨酸残基之间的s-s桥必须在进行第4步前予以断裂。.测定每一条多肽链的氨基酸组成 分离纯化的多肽链一部分样品

4、完全水解，测定氨基酸组成，计算氨基酸成分的分子比或各种残基的数目。.鉴定多肽链的n端和c端残基 多肽链的另一部分样品进行末端残基的鉴定，以便建立两个重要的氨基酸序列参考点。.裂解多肽链成较小的片段 用两种或几种不同的断裂方法（指断裂点不一样）将每条多肽链样品降解成两套或几套重叠的肽段或称肽碎片。每套肽段进行分离、纯化，并对每一纯化了的肽段进行氨基酸组成和末端残基的分析。.测定各肽断的氨基酸序列 最常用edman降解法，并有自动序列分析仪可供利用，此外尚有酶解法和质谱法等。.建立完整多肽链的一级结构 利用两套或多套肽段的氨基酸序列彼此间有交错重叠可以拼凑出原来的完整多肽链的氨基酸序列。.确定半胱

5、氨酸残基间形成的s-s交联桥的位置 氨基酸序列测定中不包括辅基成分分析，但是它应属于蛋白质化学结构内容。2.n-2.n-末端氨基酸组成的分析末端氨基酸组成的分析(1)与2，4-二硝基氟苯的反应 (sanger反应）在弱碱性溶液中，氨基酸的- 氨基很容易与2，4-二硝基氟苯（dnfb）作用，生成稳定的黄色2，4-二硝基苯基氨基酸（简写为dnp-氨基酸）。 dnfb+nccr3onccr1onccr2ohhhhhh2nccr5onccr4ohhhho2no2nfo2no2nfnccr3onccr1onccr2ohhhhhhnccr5onccr4ohhhhhclo2no2nncr1hhcooh+ot

6、her amino acidsdnp-amino acid sanger法法 dnfb （二硝基氟苯）反应二硝基氟苯）反应黄色:根据它在薄层层析或纸电泳中的迁移特性进行鉴定 丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的简称+hci 这个反应首先被edman用于鉴定多肽或蛋白质的n-末端氨基酸。 在弱碱性条件下，氨基酸中的-氨基还可以与异硫氰酸苯酯（pitc）反应，产生相应的苯氨基硫甲酰氨基酸（ptc-氨基酸）。在无水酸中，ptc-氨基酸即环化为苯硫乙内酰脲（pth），后者在酸中极稳定，此法最大优点是水解除去末端标记的氨基酸产基时不会破坏余下的多肽链。 +pitc弱碱中弱碱中(400 c)苯硫乙内酰脲苯硫乙内酰

7、脲(pth-aa)(pth-aa)(无水氢氟酸中无水氢氟酸中)h+苯氨基硫甲酰氨基酸苯氨基硫甲酰氨基酸（ptc-ptc-氨基酸）氨基酸）（edman反应）反应）.2021-10-30南京农业大学 生命科学学院16（4）氨肽酶法从多肽链的从多肽链的n n未端依次向内切未端依次向内切 nhnh2 2 -aa-aa-aa-aa. 据一定时间内释放出的据一定时间内释放出的aaaa的数量和种的数量和种类来推测类来推测. . 3. c-未端的测定方法肼解法 多肽与肼在无水条件无水条件下加热，c-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与c-端氨基

8、酸分离。 注:末端若为半胱氨酸或胱氨酸半胱氨酸或胱氨酸就不能用此法，必须烷基化后再肼解。h2nch crohnch croorncchhnohn-1n-端氨基酸 c-端氨基酸orncchh2nohh2nch cronhnh2+h+nh2nh2氨基酸酰肼c-端氨基酸用自动序列分析仪测序用自动序列分析仪测序仪器原理：edman法。1967液相测序仪 自旋反应器，适于大肽段。1971固相测序仪表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的端。1981气相测序仪 用polybrene反应器。 （聚阳离子）四级铵盐聚合物 液相：5nmol 20-40肽 97% 气相：5pmol 60 肽 98%蛋白质序列仪的

9、结构示意图序列仪反应室的结构 20 种pth氨基酸hplc图谱二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定1、二硫键的确定（对角线电泳法）二硫键的确定（对角线电泳法）碘乙酰胺封闭-sh胃蛋白酶酶解蛋白质第一向电泳过甲酸氧化ss生成-so3h第二向电泳分离出含二硫键的两条短肽，测序与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。 样品蛋白质经硫氧还蛋白处理后，利用荧光巯基探针标记巯基，目标蛋白会带上荧光探针。再进行对角线电泳时，如果发现目标蛋白存在分子内二硫键，则经处理后所得的点位于对角线的上方；如果目标蛋白存在分子间二硫键，则经处理后得到的点位于对角线的下方。 2、酰胺的确定酰胺的确

10、定asp（天冬氨酸） asn（天冬酰胺）、glu（谷氨酸）-gln酶解肽链，产生含单个asx或glx的肽，用电泳法确定是asp还是asn举例：leu-glx-pro-val肽在ph=6.0 时，电荷量是 leu+ pro0 val- 此肽除glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是glu或是gln。3、糖、脂、磷酸基位置的确定糖、脂、磷酸基位置的确定糖类通过asn、ser与蛋白质连接，-n-糖苷 -c-糖苷脂类：ser、 thr（苏氨酸）、cys（半胱氨酸）磷酸：ser、 thr、his经验性序列： lys(arg)-ser-asn-ser(po4)arg-thr-leu-ser(po4

11、)lys(arg) ala-ser(po4)序列测试时应注意的问题 一、与样品相关的因素（1）样品纯度：90%, 盐含量在mmol/l内，不含变性剂（如sds)等杂质，其n-端必须是均一的高纯样品。例如样品中含2个混合物，只有含量相差4-5倍以上才能对主序列和次序列进行分析。纯度鉴定方法：a：质谱b ：sds-pagec ：hplcd ：hpce 一般采用2种以上的方法加以验证。（2）样品量： 至少需要10pmol,例如标准蛋白质测定：10pmol样品可以测定20氨基酸残基。 一般样品量大于50pmol或者更多测定序列越长。如分子量为20000的蛋白质，50pmol约为1微克。所以蛋白质n-端

12、测序属于常规测定。（）样品存在状态a 液体：液体样品中不能含有蛋白酶以防降解，同时样品测试前不能放置太久，在20以下保存，最好尽早测试。b 转膜样品：样品经凝胶电泳分离后，应马上进行电转移至pvdf膜上面，转膜前不能放置很久以防止样品扩散。含有样品的pvdf可以用滤纸夹住保持在密封塑料袋中，可以在冰箱保存3-6个月。（）如果样品没有任何信号峰，要考虑蛋白n-端封闭。具报道约50%天然蛋白质n-端被修饰如乙酰化，甲酰化，焦谷氨酸化，须经蛋白质化学降解或酶切后分离后分析。 有时样品在分离纯化中中会产生n-端封闭，主要由于溶液中去垢剂或化学物质与蛋白样品n-端功能基团反应，或者分离纯化中ph过高（p

13、h9-10）转膜样品要求： （）为防止部分蛋白质在电泳过程被胶内杂质而封闭末端，请预先自做预电泳。即用低电压跑空胶2.5h再上样电泳分离。 （）电泳过程中，用尽量量避条带带拖现现，用于测序的条带用狭窄清晰。而且必须保证一定的量，测定20个氨基酸以上的蛋白质，至少需要2-3条明亮，清晰的条带。 （)样品转膜后请用coomassier250染色分钟，量避使用coomassieg250. ( 4 ) 含样品的pvdf膜夹在滤纸间保存在密封塑料袋中，冰箱内可以放置-6月（），电泳缓冲液建议使用缓冲液，而不要使用ris-甘氨酸缓冲液。二、edman降解与仪器有关的因素 （1）由于各种氨基酸残基化学或物理

14、性质不同，因此判断其含量时pth信号的强弱会发生变化。如：丝氨酸和苏氨酸因发生脱羟基而破坏，半胱氨酸被修饰很难有信号，组氨酸和精氨酸由于极性而难以萃取，蛋氨酸极易氧化而收率低。 （2）修饰残基在检测时接近或覆盖已知氨基酸时会造成氨基酸识别错误。 （3）测序用的化学试剂必须具有高的纯度，消除一切可能导致在pth色谱中产生的假峰，所有试剂和溶剂均保证测序级。二、二级结构的测定 圆二色光谱法（圆二色光谱法（cd） 肽键是高度有规律排列的，其排列的方向性决定了肽键能肽键是高度有规律排列的，其排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况。具有不同二级结构的蛋白质或多肽所级跃迁的分裂情况。具有不同二级结构的蛋

15、白质或多肽所产生产生cd谱带的位置、吸收的强弱都不相同。谱带的位置、吸收的强弱都不相同。因此，因此，根据所测得蛋白质根据所测得蛋白质或多肽的远紫外或多肽的远紫外cd谱，谱，能反映出蛋白质或多肽链能反映出蛋白质或多肽链二级结构的信息，从而揭二级结构的信息，从而揭示蛋白质或多肽的二级结构。示蛋白质或多肽的二级结构。2021-10-3035南京农业大学 生命科学学院2. 二级结构的测定 傅立叶红外光谱法傅立叶红外光谱法 原理：红外光谱的形成是以分子的振动为基础，在生物原理：红外光谱的形成是以分子的振动为基础，在生物大分子中，这些振动（化学键的伸缩、扭曲、旋转等）大分子中，这些振动（化学键的伸缩、扭曲

16、、旋转等）能定位到分子中特殊的键和基团，有关的键和基团能定位到分子中特殊的键和基团，有关的键和基团主要包括主要包括c=o，-cooh，coo-，o-h，s-h等。故可等。故可以通过红外光谱推知蛋白质以通过红外光谱推知蛋白质的相关结构信息。的相关结构信息。2021-10-3036南京农业大学 生命科学学院蛋白质的各种二蛋白质的各种二级结构在红外光级结构在红外光谱酰胺谱酰胺i i区的特区的特征吸收。征吸收。 3. 三级结构的测定 x射线衍射法射线衍射法 原理：当一束原理：当一束x射线照射到晶体上，首先被电子所散射，每射线照射到晶体上，首先被电子所散射，每个电子都是一个新的辐射波源，向空间辐射出与入

17、射波同个电子都是一个新的辐射波源，向空间辐射出与入射波同频率的电磁波。由于这些散射波之间的干涉作用，使得空频率的电磁波。由于这些散射波之间的干涉作用，使得空间某些方向上的波始终保持相互叠加，于是在这个方向上间某些方向上的波始终保持相互叠加，于是在这个方向上可以观测到衍射线，而另一些方向上的波则始终互相抵消，可以观测到衍射线，而另一些方向上的波则始终互相抵消，于是就没有衍射线产生。于是就没有衍射线产生。x射线在晶体中的衍射现现，实质射线在晶体中的衍射现现，实质上是大量的原子散射波互相干涉的结果。上是大量的原子散射波互相干涉的结果。 晶体所产生的衍射花样都反映出晶体内部的原子分布规律。晶体所产生的

18、衍射花样都反映出晶体内部的原子分布规律。一个衍射花样的特征，可以认为由两个方面的内容组成：一个衍射花样的特征，可以认为由两个方面的内容组成： 衍射线在空间的分布规律，称之为衍射几何，衍射线的分布规律是晶胞的大小、形状和位向决定。 衍射线束的强度，衍射线的强度则取决于原子的品种和它们在晶胞中的位置。2021-10-3037南京农业大学 生命科学学院三级结构的测定 三维电镜重构技术三维电镜重构技术 原理：在电镜下观察生物大分子时，观察的对现是三维结原理：在电镜下观察生物大分子时，观察的对现是三维结构，电镜图像是这些三维结构的二维投影。由生物结构的构，电镜图像是这些三维结构的二维投影。由生物结构的二

19、维电镜图像推知其三维结构的方法称为三维电镜方法。二维电镜图像推知其三维结构的方法称为三维电镜方法。 优点：可以直接获得分子的形貌信息；适于解析那些难以优点：可以直接获得分子的形貌信息；适于解析那些难以结晶的膜蛋白，大分子复合体等；适于捕捉动态结构变化结晶的膜蛋白，大分子复合体等；适于捕捉动态结构变化信息；易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的信息；易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结构信息；电镜图像中包含相位信息，所以在相位确定上结构信息；电镜图像中包含相位信息，所以在相位确定上要比要比x射线晶体学直接和方便。射线晶体学直接和方便。 不足：由于生物样品易受辐照损伤、图像衬度低、

20、信噪比不足：由于生物样品易受辐照损伤、图像衬度低、信噪比低的特点，它对生物大分子的高分辨率结构解析非常困难。低的特点，它对生物大分子的高分辨率结构解析非常困难。2021-10-3038南京农业大学 生命科学学院三、蛋白质二级结构预测蛋白质二级结构预测1、二级结构预测概述、二级结构预测概述 蛋白质的二级结构预测的基本依据是：蛋白质的二级结构预测的基本依据是：每一段相邻的氨基酸残基具有形成一定二级结每一段相邻的氨基酸残基具有形成一定二级结构的倾向。构的倾向。 二级结构预测问题是模式分类问题二级结构预测问题是模式分类问题 二级结构预测的目标：二级结构预测的目标： 判断每一段中心的残基是否处于判断每一

21、段中心的残基是否处于 螺旋、螺旋、 折叠、转折叠、转角（或其它状态）之一的二级结构态，即三态。角（或其它状态）之一的二级结构态，即三态。 基本策略（1）相似序列相似结构qlmgerirarrkklkqlmgaerirarrkklk结构？结构？基本策略（2）分类分析螺旋提取样本提取样本聚类分析聚类分析学习分类规则学习分类规则预测预测.-gly-ala-glu-phe-. 二级结构预测的方法大体分为三代： 第一代是基于单个氨基酸残基统计分析 从有限的数据集中提取各种残基形成特定二级结构的倾向，以此作为二级结构预测的依据。 第二代预测方法是基于氨基酸片段的统计分析 统计的对现是氨基酸片段 片段的长度

22、通常为11-21 片段体现了中心残基所处的环境 在预测中心残基的二级结构时，以残基在特定环境形成特定二级结构的倾向作为预测依据 这些算法可以归为几类： （1）基于统计信息 （2）基于物理化学性质 （3）基于序列模式 （4）基于多层神经网络 （5）基于多元统计 （6）基于机器学习的专家规则 （7）最邻近算法 第一代和第二代预测方法对三态预测的准确第一代和第二代预测方法对三态预测的准确率都小于率都小于70%，而对，而对 折叠预测的准确率仅为折叠预测的准确率仅为28 48% 其主要原因是只利用局部信息其主要原因是只利用局部信息 第三代方法（考虑多条序列）第三代方法（考虑多条序列） 运用长程信息和蛋白

23、质序列的进化信息运用长程信息和蛋白质序列的进化信息 准确度有了比较大的提高准确度有了比较大的提高2、蛋白质二级结构预测方法、蛋白质二级结构预测方法(1) 经验参数法经验参数法蛋白质二级结构的组成规律性比较强蛋白质二级结构的组成规律性比较强三种基本二级结构平均占氨基酸残基的三种基本二级结构平均占氨基酸残基的85%各种二级结构非均匀地分布在蛋白质中各种二级结构非均匀地分布在蛋白质中螺旋的形成规律：螺旋的形成规律：在一段序列中发现第在一段序列中发现第i、i+3、i+4位（如位（如1、4、5）是疏水残基时，这一片段就被预）是疏水残基时，这一片段就被预测为测为螺旋；螺旋；当发现第当发现第i、i+1、i+

24、4位（如位（如7，8，11）为疏水残基时，这一片段中被预测为为疏水残基时，这一片段中被预测为螺螺旋。旋。对于对于折叠的形成规律：折叠的形成规律：对于对于折叠，中存在着一些特征的亲疏水折叠，中存在着一些特征的亲疏水残基间隔模式，埋藏的残基间隔模式，埋藏的折叠通常由连续折叠通常由连续的疏水残基组成，一侧暴露的的疏水残基组成，一侧暴露的折叠则通折叠则通常具有亲水常具有亲水-疏水的两残基重复模式。疏水的两残基重复模式。原则上，通过在序列中搜寻特殊的亲疏水原则上，通过在序列中搜寻特殊的亲疏水残基间隔模式，就可以预测残基间隔模式，就可以预测螺旋和螺旋和折叠。折叠。点模式方法：点模式方法：将将20种氨基酸残基分为亲水、疏水以及两性残种氨基酸残基分为亲水、疏水以及两性残基三类基三类用八残基片段表征亲疏水间隔模式用八残基片段表征亲疏水间隔模式以一个二进制位代表一个残基，疏水为以一个二进制位代表一个残基，疏水为1，亲，亲水为水为0，共八位。，共八位。这样，八残基片段的亲疏水模式可用这样，八残基片段的亲疏水模式可用0 255的